閆 雷，于 淼，張景欣，李淑芹，侯利園，秦智偉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，哈爾濱 150076；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

農(nóng)藥對(duì)土壤的污染與土壤微生物群落多樣性關(guān)系一直是土壤農(nóng)藥污染生態(tài)評(píng)價(jià)的熱點(diǎn)問(wèn)題[1]，農(nóng)藥大劑量施用，導(dǎo)致農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染[2-3]，引起環(huán)境微生態(tài)功能及組成（如微生物種群、數(shù)量、酶的種類及活性）改變，從而影響土壤環(huán)境質(zhì)量，造成生態(tài)破壞。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)于土壤微生物群落的研究從基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學(xué)階段進(jìn)入免培養(yǎng)的分子生物學(xué)階段[4]。出現(xiàn)（2D-PAGE）[5]、基因芯片技術(shù)[6]和高通量測(cè)序技術(shù)[7-8]等新興技術(shù)。DGGE（Denaturing gradient gel electrophoresis，變性梯度凝膠電泳）最早是一項(xiàng)用于DNA突變檢測(cè)的電泳技術(shù)[9]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物的生態(tài)研究中，如高熱溫泉、湖泊、海洋、土壤和根際等[10]。國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于農(nóng)藥對(duì)土壤微生物群落影響的研究報(bào)道[11-13]，Sigler和Turco采用DGGE法研究發(fā)現(xiàn)，殺真菌劑百菌清處理的各種土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照土壤存在顯著差異[14]；郝乙杰的研究表明百菌清對(duì)土壤微生物群落物種豐富度影響不大[15]；而王秀國(guó)研究發(fā)現(xiàn)，多次重復(fù)施用多菌靈后，土壤微生物的優(yōu)勢(shì)種群大量繁殖，群落豐富度和均一性均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)[16]。對(duì)于代森錳鋅和霜霉威研究少見(jiàn)報(bào)道。

百菌清、代森錳鋅和霜霉威是北方蔬菜保護(hù)地種植中常用的高效低毒殺菌劑。關(guān)于殺菌劑對(duì)北方黑土中微生物群落多樣性研究相對(duì)較少；對(duì)于代森錳鋅和霜霉威的影響研究更不多見(jiàn)。為評(píng)價(jià)殺菌劑施用的安全性及其對(duì)土壤質(zhì)量的影響，本研究從農(nóng)藥種類和農(nóng)藥用量入手，利用PCRDGGE技術(shù)，揭示三種殺菌劑對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，旨在為農(nóng)藥的安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土樣：試驗(yàn)土樣采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地，挖0～20 cm耕作層土壤，在室溫下風(fēng)干，過(guò)1 mm篩備用。土壤理化性質(zhì)用常規(guī)方法分析[17]，土壤有機(jī)質(zhì)55.39 g·kg-1、全氮3.101 g·kg-1、全磷 1.697 g·kg-1、速鉀126.6 mg·kg-1、堿解氮281.3 mg·kg-1、速磷276.1 mg·kg-1、緩效鉀2 160 mg·kg-1及pH 6.38。

供試農(nóng)藥：百菌清（純度75%,江陰市利港精細(xì)化工廠）；代森錳鋅（純度70%陜西上格之路生物科學(xué)有限公司）；霜霉威（又稱普力克，純度722 g·L-1，德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司）均為市售農(nóng)藥。

1.2 農(nóng)藥處理

稱取相當(dāng)于200 g干土的新鮮土樣，置于紙杯當(dāng)中，調(diào)節(jié)土壤含水率達(dá)到20%，添加以水稀釋的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，使三種農(nóng)藥在土壤中濃度分別達(dá)到50、100、200和500 mg·kg-1，以不加農(nóng)藥的土壤作為對(duì)照，放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后從各處理中取出2 g土樣分別進(jìn)行土壤細(xì)菌群落多樣性的測(cè)定。

1.3 土壤微生物總DNA的提取和純化

參照Z(yǔ)hou[18]和Watanabe[19]方法提取土壤DNA，用DNA回收試劑盒，按照純化試劑盒說(shuō)明書(shū)完成對(duì)DNA的純化過(guò)程。純化前后的DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用的引物[20]對(duì)341-f和534-r進(jìn)行PCR，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為250 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。

341-f：5'ATTACCGCGGCTGCTGG 3'534-r：5'（GC）-CCTACGGGAGGCAGCAG 3'（GC）clamp:CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G

1.5 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）

聚丙烯酰胺的濃度為8%，變性劑梯度為40%～60%。變性劑膠溶液的配制及電泳的操作步驟參照周?；ǖ姆椒╗21]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)BIO-RAD的凝膠影像系統(tǒng)所呈現(xiàn)電泳條帶，利用分析軟件Quantity one 4.6.2進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)處理過(guò)程中同時(shí)還應(yīng)用到統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0和Excel 2003等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性影響指紋圖譜

圖1為殺菌劑處理后土壤細(xì)菌16S rDNA的DGGE圖譜。DGGE可以根據(jù)DNA解鏈行為的不同，檢測(cè)發(fā)生單個(gè)堿基變化的DNA片段，或分離具有相同長(zhǎng)度但不同序列的DNA。圖中的每一個(gè)條帶都代表土壤樣品微生物群落中的一種細(xì)菌，條帶的濃淡度則代表這種細(xì)菌數(shù)量的多少和豐富程度。所得圖像經(jīng)軟件Quantity One 4.6.2分析、數(shù)字化并扣除背景強(qiáng)度后，檢測(cè)出條帶的位置、強(qiáng)度及數(shù)目（如圖1所示）。

圖1 殺菌劑處理后土壤細(xì)菌16S rDNA的DGGE圖譜Fig.1 16S rDNA PCR-DGGE profiles of greenhouse soil bacteria after treatment with fungicides

從圖1可以看出，樣品圖譜在條帶數(shù)目和位置上有一定差異。其條帶數(shù)為14～20條不等，其中空白樣品的條帶數(shù)為16條，條帶數(shù)目最多的是經(jīng)霜霉威200 mg·kg-1濃度處理的樣品；經(jīng)霜霉威100 mg·kg-1濃度處理的樣品條帶數(shù)最少。同時(shí)，DGGE各條帶間具有很高的相似性，許多條帶是共有的，只是亮度存在差異，如條帶2、6、7、13和16等。說(shuō)明這些條帶代表的細(xì)菌具有一定的耐受性，基本不受殺菌劑濃度和種類的影響。而另一些條帶所代表的微生物在受到外來(lái)藥劑的影響后表現(xiàn)出復(fù)雜變化：如對(duì)于某優(yōu)勢(shì)種（條帶2）來(lái)說(shuō)，在施入500 mg·kg-1的百菌清后條帶亮度明顯變暗，而200 mg·kg-1的代森錳鋅處理后條帶卻亮度很大；高濃度霜霉威施用后，使條帶數(shù)目不但沒(méi)有減少反而增加，說(shuō)明在高濃度霜霉威誘導(dǎo)下產(chǎn)生了新的細(xì)菌種類，使土壤細(xì)菌多樣性增加；從條帶深淺來(lái)看，這些新增細(xì)菌種群中有些逐漸成為優(yōu)勢(shì)微生物。

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜的主成分分析（Principal component analysis，PCA）

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜的主成分分析見(jiàn)圖2，可進(jìn)一步顯示不同樣品土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異。得到3個(gè)主成分PC1、PC2和PC3，分別解釋了總變異的33.01%，20.99%和16.01%，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)70.01%。

從圖2可以看出，在以3個(gè)主成分為坐標(biāo)軸構(gòu)建的三維坐標(biāo)系中，13個(gè)土壤樣本之間出現(xiàn)明顯的空間分異。其中PC1主要由L1決定，PC2主要由L10決定，說(shuō)明與空白相比各處理殺菌劑對(duì)土壤微生物群落均存在差異，而受影響最嚴(yán)重的為霜霉威50 mg·kg-1，其他處理的微生物種群對(duì)于外來(lái)農(nóng)藥的污染敏感性較弱，影響不顯著。

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜的聚類分析

殺菌劑處理后土壤細(xì)菌16S rDNA DGGE指紋圖譜的聚類分析見(jiàn)圖3，表明各處理土壤細(xì)菌種群之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。其結(jié)果顯示：所有供試土樣的遺傳相似性為30%，在50%的相似性水平處可將13個(gè)供試土樣分為三類，霜霉威50 mg·kg-1獨(dú)自一簇，表明該土樣細(xì)菌多樣性與其他樣本之間存在明顯的遺傳多態(tài)性差異，這與以上PCA的結(jié)論“受影響最嚴(yán)重的為霜霉威50 mg·kg-1”相一致；除了100 mg·kg-1濃度外，百菌清處理后，細(xì)菌聚類分析時(shí)歸為一類，說(shuō)明濃度為50、200和500 mg·kg-1的百菌清對(duì)土壤細(xì)菌種群影響相近，且50 mg·kg-1濃度處理的百菌清與對(duì)照樣本之間有較高的相似性，表明該濃度處理的百菌清對(duì)土壤細(xì)菌微生物幾乎無(wú)影響；其他8個(gè)處理成一簇，說(shuō)明其他處理供試土樣均對(duì)細(xì)菌種群產(chǎn)生了不同程度的影響，但在遺傳上存在較小的遺傳差異。

圖2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜的主成分分析Fig.2 Principle components analysis of bacteria community in greenhouse soil based on DGGE profile

圖3 殺菌劑處理后土壤細(xì)菌16S rDNA DGGE圖譜的聚類分析樹(shù)狀Fig.3 Cluster analysis of 16S rDNA PCR-DGGE profiles of greenhouse soil bacteria after treatment with fungicides

3 討論與結(jié)論

與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，DGGE技術(shù)進(jìn)行微生物多樣性分析優(yōu)點(diǎn)是突變檢出率高、檢測(cè)片段長(zhǎng)度長(zhǎng)、重復(fù)性好等[22]，也存在局限性，如DGGE所檢測(cè)的DNA片段長(zhǎng)度一般都在300～1 000 bp，只能鑒定到屬[23]。本研究對(duì)土壤細(xì)菌群落作PCR-DGGE淺層次分析，而未對(duì)DGGE圖譜上出現(xiàn)的特異性條帶進(jìn)行回收和分子克隆，沒(méi)有考慮該影響因素，今后應(yīng)將受影響細(xì)菌群落作深入研究。

土壤細(xì)菌在高濃度霜霉威誘導(dǎo)下增加新種群，使細(xì)菌多樣性增加，有些種群逐漸成為優(yōu)勢(shì)種群。低濃度霜霉威對(duì)土壤細(xì)菌微生物群落的影響最大，其他農(nóng)藥及劑量處理對(duì)于外來(lái)農(nóng)藥的污染敏感性較弱，影響不顯著，尤其是低濃度處理的百菌清對(duì)土壤細(xì)菌群落無(wú)影響。

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