姜杉 陳日玲 邸曉華 劉曉利 田川

酪氨酸激酶（PTKs）是一種新型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，通過(guò)抑制酪氨酸激酶的磷酸化，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)、酪氨酸激酶的過(guò)度激活導(dǎo)致其下游信號(hào)途徑的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖和抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存，進(jìn)而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。其抑制劑中的一種PTK787可抑制多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，已有研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)利用PTK787作用于K562細(xì)胞，研究其對(duì)K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的作用，以進(jìn)一步探討PTK787抗白血病細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人慢性粒細(xì)胞白血病急變期K562細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。酪氨酸激酶抑制劑PTK787由瑞士諾華公司惠贈(zèng)。MTT購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞在含10%小牛血清，100μmol/L的青、鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PTK787對(duì)K562細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 使用分別加入10 μl不同濃度的PTK787作用K562細(xì)胞48 h后，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)變化情況，并拍照。

1.2.3 MTT法檢測(cè)PTK787對(duì)K562細(xì)胞的增殖作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好的白血病K562細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各實(shí)驗(yàn)組加入含10 μl不同濃度PTK787的細(xì)胞培養(yǎng)液。接種完畢后在37 ℃，5%CO2條件下孵育培養(yǎng)12、36、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl，混勻后37 ℃，5% CO2條件下孵育4 h，加入三聯(lián)細(xì)胞裂解液（SDS 10 g，異丁醇5 ml，10M HCl 0.1 ml用雙蒸水溶解配成100 ml溶液）100 μ l，37 ℃溫育12～20 h，用丹尼酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。細(xì)胞抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組光密度-空白對(duì)照組光密度）/（陰性對(duì)照組光密度-空白對(duì)照組光密度）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PTK787對(duì)K562細(xì)胞周期作用 6孔板每孔加入等量細(xì)胞以及10 μl不同濃度的PTK787，培養(yǎng)48 h，冷PBS洗滌離心2次，棄PBS。用70%冰乙醇固定12 h，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml；用冷PBS洗滌2次，棄PBS。加入PI染液0.6 ml，避光染色半小時(shí)后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。打印DNA含量直方圖，自動(dòng)擬合細(xì)胞周期各時(shí)相比例。重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPASS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間每?jī)蓚€(gè)均數(shù)的比較根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)總體方差齊同時(shí)選擇LSD法；當(dāng)總體方差不齊時(shí)，選擇Tamhane T2法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTK787對(duì)K562細(xì)胞增殖作用情況的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 以下為不用濃度PTK787作用K562細(xì)胞48 h后相差顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)變化圖。陰性對(duì)照組為生長(zhǎng)48 h的K562細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)規(guī)則，密集平鋪在培養(yǎng)板。加入不同濃度的PTK787作用細(xì)胞48 h，且藥物濃度逐漸升高，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)均有改變，呈濃度相關(guān)性。見(jiàn)圖1。

圖1 不用濃度PTK787作用K562細(xì)胞48 h后相差顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)變化圖

2.2 PTK787對(duì)K562細(xì)胞增殖的作用 不同濃度的PTK787作用于K562細(xì)胞12、36、48、72 h后，用MTT法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表明PTK787對(duì)K562細(xì)胞有明顯的抑制作用。隨著PTK787濃度增加與作用時(shí)間延長(zhǎng)，K562的增殖抑制率逐漸升高。同一時(shí)間不同濃度組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同一濃度不同時(shí)間組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示PTK787作用48 h，濃度為320 μmol/L對(duì)細(xì)胞抑制最明顯。繼續(xù)增加濃度或延長(zhǎng)作用時(shí)間抑制率增加不明顯。（圖1）。

2.3 PTK787對(duì)K562細(xì)胞周期的作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期表明，PTK787顯著改變G1期與S期細(xì)胞比例。加入20、40、80、160、320 μmol/L PTK787的細(xì)胞組分別與陰性對(duì)照組相比較，G1期細(xì)胞比率均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。G1期細(xì)胞組與S期細(xì)胞組各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但是PTK787濃度由160 μmol/L繼續(xù)升高時(shí)，G1期與S其細(xì)胞比率改變不明顯。提示PTK787抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與減慢G1/S期的轉(zhuǎn)換有關(guān)。見(jiàn)表2。

表1 PTK787對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制率 %

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組K562細(xì)胞各周期的細(xì)胞比率

3 討論

蛋白酪氨酸激酶按其結(jié)構(gòu)可分為受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinases，RTKs）和非受體酪氨酸激酶（non-receptor protein tyrosine kinases，nrPTKs）[2]。PTK787/ZK222584是一種新型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，PTK787可抑制多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3-5]，研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[6]。酪氨酸激酶在腫瘤形成過(guò)程中起著重要作用，這一方面究已經(jīng)取得很多進(jìn)展。酪氨酸激酶功能的失調(diào)，會(huì)導(dǎo)下游信號(hào)途徑激活，引起細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤形成[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度PTK787作用于K562細(xì)胞后，觀(guān)察對(duì)細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期作用的影響。結(jié)果表明，PTK787具有明顯抗白血病作用，主要表現(xiàn)在：（1）抑制K562細(xì)胞增殖，藥物濃度從20 μmol/L升高到320 μmol/L，細(xì)胞的增殖抑制率明顯升高（P<0.05），其中藥物濃度以320 μmol/L，作用時(shí)間為48 h時(shí)細(xì)胞的抑制率最高。繼續(xù)提高藥物濃度和延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間細(xì)胞抑制無(wú)明顯改變；（2）阻止K562細(xì)胞周期G1期想S期轉(zhuǎn)換；S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)刻，DNA復(fù)制、蛋白合成均在S期，所以S期細(xì)胞數(shù)目降低表明細(xì)胞增殖受到抑制。

PTK787對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制機(jī)理可能為：（1）PTK787可抑制所有已知的VEGFR酪氨酸激酶。通過(guò)與VEGFR上的三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制VEGF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷新生血管的形成而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[8]。藥物尼羅替STI571為作用于該類(lèi)受體的酪氨酸激酶抑制劑。體外研究表明，STI571可降低CML細(xì)胞系的K562細(xì)胞系和KU812F細(xì)胞系以及表達(dá)野生型BCR-ABL的前B細(xì)胞系Ba/F3的BCR-ABL自主磷酸化，抑制細(xì)胞增殖[9]。（2）通過(guò)下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增加。（3）作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期的G1期、部分G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。（4）PTK787可下調(diào)白血病細(xì)胞FAK基因的表達(dá)，而FAK類(lèi)似于癌基因的作用。從而達(dá)到抗腫瘤的作用。（5）PTK787可能通過(guò)糾正ph（﹢）CML細(xì)胞異常蛋白表達(dá)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。以往的抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常的組織細(xì)胞也有殺傷作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和從細(xì)胞受體與增殖調(diào)控的分子水平對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入，針對(duì)細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)的治療開(kāi)始進(jìn)入臨床，人們稱(chēng)其為“分子靶向治療”。臨床的酪氨酸激酶抑制劑的抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的損傷修復(fù)、使細(xì)胞分裂阻滯在G1期、誘導(dǎo)和維持細(xì)胞凋亡、抗新生血管形成等途徑實(shí)現(xiàn)。分子靶向?qū)鼓[瘤細(xì)胞不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷力，并且可使正常細(xì)胞免受損害，可大大減少化療的副作用。

最新研究進(jìn)展表明，作為促使細(xì)胞通過(guò)G1/S期限制點(diǎn)的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)失常與多種腫瘤的癌變相關(guān)。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中證明，Cyclin D1的變異參與了間變等癌變?cè)缙诓±碜兓^(guò)程。酪氨酸激酶促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能為增加細(xì)胞DNA合成和加快G1/S期的轉(zhuǎn)換。酪氨酸激酶是通過(guò)增加Cyclin D1的表達(dá)與抑制p21的協(xié)同作用來(lái)促進(jìn)DNA合成的，應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑可以阻斷這些過(guò)程[11]。這些結(jié)果均提示誘導(dǎo)酪氨酸激酶的表達(dá)對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)是正性的，而Cyclin D1可能是酪氨酸激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的基本功能靶點(diǎn)，這為下一步的研究提供了理論基礎(chǔ)。

[1] Roboz G J，Giles F J，List A F，et al.Phase l study of PTK787/ZK222584. a small molecule tyrosine kinase receptor inhibitor， for the treatment of acute myeloid leukemia and myelodys plastic syndrome[J].Leukemia，2006，20（6）：952-957.

[2] Huang W L，Zhu X F.Signal Transduction[M].Beijing：People’8 Medical Publishing House，2005：151-199.

[3] Yang Z F，Poon R T，Jiu Y，et al.High doses of tyrosine kinase Inhibitor PTK787 enhance the efficacy of ischemic on cancer cell and angiogenesis[J].Mol Cancer Ther，2006，5（9）：2261-2270.

[4] Schoenberger J，Grim D，Kossmehl P，et al.Effects of PTK787/ZK222584，a tyrosine kinase inhibitor on the growth of a poorly differentiated thyroid carcinom a an animal study[J].Endocrinology，2004，145（3）：1031-1038.

[5] Lin B，Podar K，Gupta D，et al.The vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor PTK787/ZK222584 inhibits growth and migration of multiple myelom a cells in the bone marrow microenvironment[J].Cancer Res，2002，62（17）：5019-5026.

[6] Roboz G J，Giles F J，List A F，et al.Phase l study of PTK787/ZK 222584.a small molecule tyrosine kinase receptor inhibitor，for the treatment of acute myeloid leukemia and myeloid ys plastic syndrome[J].Leukemia，2006，20（6）：952-957.

[7]茆勇軍，李海泓，李劍峰，等.蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與抗腫瘤藥物[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（4）：323，334.

[8] Bold G， Buchdtmger E.PTK787/ZK 222584， a novel and potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases，impai vascular endothelial growth factor-induced responses and tumor growth after oral administration[J].Cancer Res，2000，60（8）：2178-2189.

[9] Le Coutre P， Ottmann O G， Giles F.Nilotinib formerly AMN107，a highly selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor，is active in patients with imatinib resistant or intolerant accelerated-phase chronic myelogenous leukemia[J].Blood，2008，1114（1）：1834-1839.

[10] Liu Y，Poon R T，Li Q，et a1.Both antiangiogenesis and angiogenesis independent effects are responsible for hepatocellular carcinoma growth， arrest by tyrosine kinase inhibitor K787/ZK222584[J].Cancer Res，2005，65（9）：3691-3699.

[11] Zhao J，Pestell R，Guan J L.Transcriptional activation cyclin D1 promoter by FAK contributes to cell cycle progression[J].Mol Biol Cell，2001，12（1）：4066-4077.