王彩云，馬云瀚，何大健，楊世華

1. 昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；

2. 昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；

3. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650223

樹(shù)鼩 (tree shrews，Tupaia belangeri)被認(rèn)為是最接近于靈長(zhǎng)類(lèi)的小型哺乳類(lèi)動(dòng)物，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中 (Xu et al，2013)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cells, iPSc)是指轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Sox2和c-Myc等促使體細(xì)胞重編程 (Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)，使其成為具有多潛能性的干細(xì)胞。因?yàn)閕PS細(xì)胞能形成嵌合體動(dòng)物而體現(xiàn)其全能性，掀起了人類(lèi)再生醫(yī)學(xué)研究的熱潮。Sox2基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于維持胚胎神經(jīng)嵴干細(xì)胞多能性具有重要作用 (Laga et al，2010)。由Oct4和Sox2基因組成的調(diào)控復(fù)合物控制基因表達(dá)對(duì)于維持早期細(xì)胞發(fā)育非常重要 (Okumura-Nakanishi et al，2005)。C-Myc是一種原癌基因，失去該基因后細(xì)胞的重編程進(jìn)度及效率均會(huì)顯著降低 (Shi et al，2008)。Klf4能夠連接Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域并直接調(diào)控其表達(dá)，因此，在防止胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的分化中起重要作用，同時(shí)，它也是維護(hù)細(xì)胞自我更新和保持多能性的重要基因 (Zhang et al，2010)。

小鼠及人類(lèi)等的體細(xì)胞均可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Sox2、c-Myc及Oct4等誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞(Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)。但樹(shù)鼩多潛能轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列至今未見(jiàn)報(bào)道，影響了樹(shù)鼩iPSc的研究，因此，本研究克隆并解析了樹(shù)鼩的多潛能因子Klf4、Sox2和c-Myc等，為研究樹(shù)鼩iPSc及基因轉(zhuǎn)錄分析提供了重要數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取健康成體樹(shù)鼩的骨髓和妊娠期～30 d孕體的不同組織器官 (肝臟、腸及大腦等)。

1.2 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)

通過(guò) GenBank公布的人(NM004235；NM002467；NM003106)、獼猴(NM001142793；NM001142873；NM001142940)、牛(NM001105385；NM001046074；BC133458)及豬等(EU669075；FJ882404；EU503117)的Klf4、Sox2和c-Myc基因序列，用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 (Table 1)。

表1 Klf4、Sox2和c-Myc簡(jiǎn)并引物Table 1 Klf4,Sox2 and c - Myc degenerate primer

1.3 樹(shù)鼩總RNA提取及簡(jiǎn)并PCR法擴(kuò)增目的基因

使用RNA prep pure tissue kit (TIANGEN公司)提取樹(shù)鼩組織總 RNA，提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)驗(yàn)按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系為25 μL： DNA 2 μL，10× 緩沖液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上、下游引物各1 μL，easy TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 45 s，58～60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離并純化，再將Klf4、Sox2和c-Myc純化產(chǎn)物與pMD18T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37℃轉(zhuǎn)化株在提供X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基中孵育12 h。藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落，且每個(gè)基因挑取 5個(gè)不同的陽(yáng)性菌落37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，挑取菌斑用于基因測(cè)序。測(cè)序由上海生工測(cè)序公司完成。

1.4 序列分析

所得序列經(jīng)校對(duì)后，進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast分析，同時(shí)通過(guò)在線軟件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)對(duì)獲得的樹(shù)鼩 Klf4、Sox2和c-Myc的部分序列進(jìn)行氨基酸推導(dǎo)。然后從GenBank中下載不同物種的Klf4、Sox2和c-Myc基因，利用 MEGALIGN對(duì)序列進(jìn)行排列，并應(yīng)用Mega5.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。NJ分析采用Kimura two-parameter距離法，分支樹(shù)可信度測(cè)試使用自展法 (Bootstrap)檢驗(yàn)，經(jīng) 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到分支樹(shù)節(jié)點(diǎn)的支持率。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建所用序列見(jiàn)圖4、圖5和圖6。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)鼩總RNA的獲取

樹(shù)鼩總 RNA采用瓊脂糖凝膠電泳法驗(yàn)證質(zhì)量(圖 1)，所選取的兩個(gè)樣品的 rRNA 三條帶清晰，表明提取的 RNA具有良好的完整性，并適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 樹(shù)鼩組織總RNAFigure 1 Total RNA extracted from tissues of tree shrews

2.2 目的片段的檢測(cè)

RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示，目標(biāo)條帶與預(yù)期目的基因大小一致(圖2)。

圖2 樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Amplification results of Klf4, Sox2, and c-Myc genes by RT-PCR

2.3 樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的序列分析

獲得的 Sox2、c-Myc 和 Klf4部分序列長(zhǎng)度[GenBank登錄號(hào)分別為Klf4 (K1 KC480548)、Sox2(S1 KC480549) 和 c-Myc (C1 KC480547)]與預(yù)期結(jié)果一致，分別為612、485 和382 bp (測(cè)序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖3)。樹(shù)鼩Klf4部分序列與人 (Homo sapiens)、獼猴 (Macaca mulatta)、牛 (Bos taurus)、豬 (Sus scrofa)以及鼠 (Mus musculus) 等相應(yīng)序列的相似性分別為 89%、90%、90%、89%和86%，編碼127個(gè)氨基酸；Sox2部分序列與人、獼猴、牛、豬及鼠等相應(yīng)序列的相似性分別為98%、97%、96%、97%和95%，編碼204個(gè)氨基酸，且該氨基酸序列與獼猴的 Sox2氨基酸序列僅存在 1個(gè)氨基酸的差別，相似性高達(dá)99%；c-Myc部分序列與人、獼猴、牛、豬及鼠等相應(yīng)序列的相似性分別為89%、89%、90%、92%和87%，編碼161個(gè)氨基酸。

圖3 樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 3 Partial nucleotide and predicted amino acid sequences of Klf4, Sox2, and c-Myc genes in tree shrews

2.4 樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的進(jìn)化分析

在基于 Klf4部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中 (圖4)，各分支具有較高的置信度，說(shuō)明這些動(dòng)物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有較高可信度。由系統(tǒng)樹(shù)可見(jiàn)，人 (Homo sapiens)、黑猩猩 (Pan troglodytes)和獼猴 (Macaca mulatta)等聚為一類(lèi)(靈長(zhǎng)類(lèi))；牛 (Bos taurus)、羊 (Ovis aries)和豬 (Sus scrofa)等聚為一類(lèi) (偶蹄類(lèi))；小家鼠(Mus_musculus)和褐家鼠 (Rattus norvegicus)等聚為一類(lèi)(嚙齒類(lèi))。其中樹(shù)鼩以較高的支持率與靈長(zhǎng)類(lèi)聚為一支。同樣，在基于Sox2部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中 (圖5)，各類(lèi)動(dòng)物聚類(lèi)情況與Klf4類(lèi)似，樹(shù)鼩同樣與靈長(zhǎng)類(lèi)聚為一支，但支持率有所降低。由于不同類(lèi)群動(dòng)物的 Sox2基因推導(dǎo)的氨基酸同源性非常高，系統(tǒng)分析時(shí)各分支支持率很低 (結(jié)果未給出)，因而未給出其氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)。在以c-Myc部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中 (圖6)，靈長(zhǎng)類(lèi)、偶蹄類(lèi)和嚙齒類(lèi)等雖各聚為一支，但樹(shù)鼩以較高的支持率與偶蹄類(lèi)動(dòng)物聚為一支。

圖4 基于Klf4基因部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 4 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the Klf4 gene

圖5 基于Sox2基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 5 Phylogenetic tree based on partial nucleotide of the Sox2 gene

圖6 基于c-Myc基因部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 6 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the c-Myc gene

3 討論

樹(shù)鼩的分類(lèi)學(xué)及生物學(xué)特征研究較為廣泛，已證明其許多生物學(xué)特性可以作為人類(lèi)疾病模型的重要材料 (Xu et al，2013；Ping et al，2012；Zhang et al，2012)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索樹(shù)鼩的生殖工程和疾病模型提供了重要數(shù)據(jù)。

人(Homo sapiens)的Klf4、Sox2和c-Myc全長(zhǎng)分別為2 949、2 520和2 379 bp，本研究獲得的Klf4、Sox2和c-Myc部分序列長(zhǎng)度分別為382、612和485 bp，分別對(duì)應(yīng)于人相應(yīng)基因的 675～1 060 bp、729～1340 bp 和 1 082～1 566 bp?；?Klf4、Sox2 和c-Myc部分序列的進(jìn)化分析支持偶蹄動(dòng)物與靈長(zhǎng)動(dòng)物的親緣關(guān)系，較與嚙齒動(dòng)物的親緣關(guān)系更為接近，與動(dòng)物種系進(jìn)化關(guān)系相一致。在基于 Klf4和Sox2部分序列構(gòu)建的基因樹(shù)中，樹(shù)鼩與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的親緣關(guān)系更近，而與偶蹄動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但在c-Myc基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，樹(shù)鼩與偶蹄動(dòng)物的親緣關(guān)系更近。這說(shuō)明 Klf4、Sox2與c-Myc基因可能在進(jìn)化方式或速度上存在一定的差異。另外，由于本研究中暫未獲得這幾個(gè)基因的全長(zhǎng)序列而僅克隆了較為保守的部分序列，利用部分序列進(jìn)行進(jìn)化分析，可能不能很準(zhǔn)確反應(yīng)這些類(lèi)群的真實(shí)親緣關(guān)系。

由于目前 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未收錄樹(shù)鼩的Klf4和Sox2基因序列，在一定程度上限制了樹(shù)鼩的分子生物學(xué)研究。本研究采用簡(jiǎn)并 PCR擴(kuò)增，成功克隆了樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因cDNA的部分序列，為克隆這三種基因的全長(zhǎng)提供了良好基礎(chǔ)。

另外，以往的研究認(rèn)為iPS在小鼠疾病模型及胚胎干細(xì)胞研究中具有相似的功能 (Hanna et al，2007)。因此，我們假設(shè)可以通過(guò)導(dǎo)入樹(shù)鼩的3種基因Sox2、c-Myc和Klf4來(lái)誘導(dǎo)樹(shù)鼩多潛能干細(xì)胞。推測(cè)該模型的評(píng)估治療效果較小鼠模型將更加可行。目前關(guān)于樹(shù)鼩的這3個(gè)基因功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次對(duì)樹(shù)鼩Klf4、Sox2和c-Myc三個(gè)基因cDNA部分片段進(jìn)行了克隆和序列分析，旨在為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)樹(shù)鼩多潛能干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

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