徐 娟，黃曉燕，李曉飛，王文廣，殷安國，夏雪山，孫曉梅,*，代解杰,*

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；

2. 昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500

哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV) 隸屬于呼腸孤病毒科 (Reoviridea)正呼腸孤病毒屬 (Orthoreovirus)第一亞群(Van Regenmortel et al，2003)。該病毒首次由Ramos-Alvarez & Sabin于 1954年于健康兒童糞便中分離 (Huang et al，1990)。病毒核酸為雙鏈 RNA (dsRNA)，首次證實(shí)了 dsRNA可以作為穩(wěn)定的生命形態(tài)存在于自然界中 (Sabin et al, 1959)。MRV RNA分10個節(jié)段，按分子量大小可分成大 (L1，L2，L3)、中 (M1，M2，M3)和小 (S1，S2，S3，S4) 三個類群，分別編碼11種蛋白，包括 8種結(jié)構(gòu)蛋白和 3種非結(jié)構(gòu)蛋白(McCrae & Joklik，1978)。該病毒宿主范圍非常廣泛，包括人、鼠、貓、犬、豬、牛 ( Zeng et al, 2007)及蝙蝠 (Koh et al, 2012)等多種動物，甚至也在河水、貯存水及污水等中被發(fā)現(xiàn) (Spinner et al, 2001)。雖然該病毒與疾病的確切關(guān)系尚未最后確定，但是MRV可引起動物嚴(yán)重呼吸窘迫綜合癥，肺纖維化(London et al, 2003)和致死性間質(zhì)性肺炎 (Tillotson& Lemer, 1967)，且對SARS病原的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)SARS的發(fā)生可能與呼腸孤病毒的同時感染有關(guān)(Zou et al, 2003)。近幾年的相關(guān)文獻(xiàn)報道，蝙蝠源呼腸孤病毒感染人類后可導(dǎo)致急性上呼吸道疾病(Chua et al, 2011)。

雖然MRV在多種動物中被發(fā)現(xiàn)，但是目前尚無其在樹鼩 (tree shrew, Tupaia)體內(nèi)的相關(guān)報道。為了解樹鼩是否自然攜帶該病毒，2011年冬，隨機(jī)抽取6份腹瀉死亡的野生樹鼩糞便標(biāo)本，并用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，首次成功從樹鼩體內(nèi)分離出MRV。腹瀉死亡的野生樹鼩發(fā)病癥狀為精神萎靡、身體蜷縮、眼瞼和角膜紅腫、眼睛分泌物增加、爪子潰爛及血便等。解剖可見腸道出血及肺局部壞死。

樹鼩作為新興的實(shí)驗(yàn)動物，需明確其病原菌自然攜帶情況。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)樹鼩自然攜帶 MRV，為開展和制定樹鼩病毒質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)樹鼩實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生樹鼩及6份糞便樣本均采自云南省昆明市青龍峽地區(qū)；Vero傳代細(xì)胞 (由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所免疫室保存；Minimum essential medium (MEM) 液體培養(yǎng)基、1%雙抗、谷氨酰胺及碳酸氫鈉等來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所；標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；DNA膠回收試劑盒、RT-PCR試劑盒及病毒DNA/RNA提取試劑盒等購自TaKaRa生物工程有限公司；PCR反應(yīng)引物來自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

六份樹鼩糞便樣本按1:5比例加入PBS，漩渦震蕩混勻，4 000 r/min離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。將處理好的糞便上清接種于 96孔板Vero細(xì)胞單層上，每孔接種30 μL，每份上清接種16孔，于37 ℃、5%CO2孵箱中吸附90 min，每隔15 min輕輕搖晃96孔板，使病毒均勻充分地吸附到細(xì)胞上。同時，每個96孔板設(shè)置16孔空白對照。吸棄未吸附的病毒液，加入MEM維持液150 μL，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察細(xì)胞病變效應(yīng) (cytopathogenic effect，CPE)7 d，并連續(xù)盲傳三代。取盲傳三代病變的Vero細(xì)胞反復(fù)凍融3次使細(xì)胞完全裂解，于 4 ℃, 4 000 r/min 離心 30 min，棄沉淀取上清，然后4 ℃，9 000 r/min離心20 min，棄沉淀取上清，于4 ℃，55 000 r/min 離心180 min，將沉淀用適量PBS溶解，4 ℃儲存。1%磷鎢酸常規(guī)染色純化病毒后，于Hitachi 透射電鏡下觀察。

按照病毒 DNA/RNA提取試劑盒 (TaKaRa生物工程有限公司)說明書提取純化病毒核酸。提取的病毒基因組核酸樣品按 9:1的體積與 10× loading buffer 混勻后經(jīng)核酸聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)電泳(積層膠3.5%，分離膠10%), 每孔上樣15 μL，100 V恒壓。硝酸銀染色觀察。

以提取的病毒核酸為模板，對LI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系條件參照TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書。根據(jù) L1基因保守部分設(shè)計引物, 并參考Chang et al (2008)的報道(P1：5'-GCATCCATTGT AAATGACGAGTCTG-3'，P2：5'-CTTGAGATTAG CTCTAGCATCAGTTG-3')。 擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，送TaKaRa生物工程有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI在Blast上進(jìn)行基因比對，選用同源性較高序列為參考序列。

采用軟件 MEGA5.05中的臨位相連法(neighbor-joining)繪制樹鼩呼腸孤病毒L1序列與參考序列以及代表株TIL、T2J、T3D及NEDV等 L1序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自引分析法(Bootstrap,n=1 000)進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1 病毒的細(xì)胞病變(cytopathic effects，CPE)特征

六份糞便樣本在 Vero 細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離，得到 1株 MRV分離毒株 Tupaia orthoreovirus(TRV)。連續(xù)盲傳 3代后，出現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞病變。病毒接種3 d后開始產(chǎn)生細(xì)胞病變，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、細(xì)胞逐漸破碎、固縮變圓、細(xì)胞拉網(wǎng)及脫落，正常Vero 細(xì)胞生長良好 (圖1)。

圖1 正常Vero細(xì)胞及分離毒株TRV在Vero細(xì)胞上的病變Figure 1 Normal Vero cells and isolation strain TRV on the cells with cytopathic effects

2.2 電鏡觀察

電鏡下，可見大量密集排列的球形病毒顆粒，完整直徑～75 nm，內(nèi)核直徑45～55 nm，完整病毒顆粒以及“空殼顆?！本梢姡p層衣殼，形態(tài)疑似呼腸孤病毒 (圖2)。

圖2 分離毒株TRV電鏡觀察Figure 2 Electron microscopic observation of the isolation TRV

2.3 核酸聚丙烯酰胺電泳

純化的病毒DNA/RNA核酸PAGE電泳結(jié)果顯示該病毒由10個核酸節(jié)段組成，存在3個明顯的節(jié)段區(qū)，按分子量大小可分成大 (L1，L2，L3)、中 (M1，M2，M3)和小 (S1，S2，S3，S4) 三個類群，且呈現(xiàn)典型的3:3:4排列 (圖3)。

圖3 分離毒株TRV基因組節(jié)段的PAGE電泳圖譜Figure 3 PAGE analysis of the genome segments of the isolation TRV

2.4 RT-PCR產(chǎn)物

2%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，目的條帶～370 bp，與預(yù)期大小一致 (圖4)。

圖4 分離毒株TRV L1基因電泳分析Figure 4 Amplification of the isolation TRV L1 by RT-PCR

2.5 目的基因序列分析

在 NCBI Blast上進(jìn)行的序列對比結(jié)果顯示目的基因序列與代表株TIL、T2J、T3D及NEDV等的 L1基因序列的核酸同源性分別為 89%、76%、89%和 88%，與蝙蝠來源的 MRV分離株T3Germany342/08(MRV strain T3/Bat/Germany/342/08) 核酸同源性最高，達(dá)96%。進(jìn)化樹上結(jié)果表明該病毒與MRV同屬一支，且與蝙蝠來源的MRV同源性最高 (圖5)。

圖5 分離株L1基因(376 bp)的分子進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree of L1 gene sequence (376 bp) of the isolate strain and reference strains

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從樹鼩糞便中分離的 TRV病毒株可致Vero細(xì)胞逐漸破碎、固縮變圓、拉網(wǎng)及脫落；電鏡圖顯示病毒顆粒為球形，雙層衣殼，完整直徑～75 nm；純化病毒核酸PAGE膠電泳結(jié)果顯示，該病毒由10個核酸節(jié)段組成且為3:3:4排列。以上結(jié)果均符合已報道的MRV的生物學(xué)特征。為進(jìn)一步確定該病毒是否為 MRV，經(jīng) MRV L1基因保守區(qū)RT-PCR擴(kuò)增、NCBI Blast核酸序列比對及MEGA5.05構(gòu)建進(jìn)化樹，得出結(jié)果：目的基因序列與從大耳蝠 (P. auritus) 中分離出的 MRV分離株T3Ger342-08核酸同源性最高，達(dá)96%。從進(jìn)化樹上看，該病毒與MRV同屬一支，且與從大耳蝠中分離出的MRV分離株T3Ger342-08同源性最高。從而證實(shí)該毒株為 MRV，并初步命名為樹鼩呼腸孤病毒 (TRV)。

樹鼩在分類地位上為攀鼩目(Scandentia)，大耳蝠在分類地位上為翼手目(Chiroptera)小蝙蝠亞目(Microchiroptera)。攀鼩目和翼手目均置于統(tǒng)獸總目(Archonta)。從統(tǒng)獸總目系統(tǒng)進(jìn)化樹上看，攀鼩目和翼手目小蝙蝠亞目的親緣關(guān)系最為接近。樹鼩以昆蟲為主食，兼食鳥類、獸類和植物果實(shí)。大耳蝠的食物為昆蟲、鳥類、獸類以及其他蝙蝠?？梢?，樹鼩與大耳蝠的食性相似。由于樹鼩和大耳蝠親緣關(guān)系接近且食性相似，可能導(dǎo)致他們感染同一種MRV。因此，樹鼩與大耳蝠較近的親緣關(guān)系和相似的食性可能是TRV和T3Ger342-08同源性最高的因素之一。

MRV都有一個共同的complement-fixing抗原，用血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn) (Knipe et al，2001)可分為 4個血清型 (1、2、3、4型)，其代表株分別為血清型1型(ST1)代表株T1L (type 1 Lang)株、血清型2型(ST2)代表株T2J (type 2 Jones)株、血清型3型(ST3)代表株T3D (type 3 Dearing)株及血清型4型(ST4)代表株NEDV株 (Attoui et al，2001)。

Leary et al (2002)報道，MRV L1基因進(jìn)化與血清型無關(guān)。由于該目的基因來源于MRV L1基因，因此，不能通過該目的基因序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建等結(jié)果對該病毒株進(jìn)行血清型判定。Cashdollar et al(1985) 報道S1基因進(jìn)化與血清型關(guān)系密切。下一步欲獲得該毒株S1全基因序列，通過S1全基因序列比對、進(jìn)化樹構(gòu)建、血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)來判定該毒株的血清型。

MRV具有廣泛的致病性，對多種動物胃腸道(Tyler et al，1998)、上呼吸道 (Majeski et al，2003a)、肺 (Majeski et al，2003b)、心臟 (Debiasi et al，2001)及神經(jīng)系統(tǒng) (Tyler et al，2004) 等多種組織均具有一定的致病性，并能在這些發(fā)病組織及腫瘤組織中分離出MRV。多數(shù)人感染MRV后無臨床癥狀，少數(shù)出現(xiàn)輕微的呼吸道、胃腸道或神經(jīng)系統(tǒng)疾病，罕見嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡。鼠、豬、牛、猴及貓等多種動物感染MRV后，同樣會出現(xiàn)一定的臨床癥狀。如感染MRV 1型的小鼠，通常于感染后5～7 d死亡，電鏡檢測顯示神經(jīng)元及心肌等處存在大量病毒顆粒 (Huang et al, 1990)。以上結(jié)果提醒我們應(yīng)該謹(jǐn)慎對待MRV。TRV的首次分離，為國內(nèi)外開展TRV的相關(guān)研究如病毒生物學(xué)特征、基因組結(jié)構(gòu)和功能、致病機(jī)制以及與疾病的關(guān)系等奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示樹鼩是MRV的自然宿主。目前，正在開展樹鼩實(shí)驗(yàn)動物化的研究，因此樹鼩可以作為一種研究MRV的良好動物模型。

MRV是人獸共患病病毒，不僅會影響動物的生命健康、干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性，而且可能危害實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員的生命健康，為此，建議將MRV列為實(shí)驗(yàn)樹鼩病毒質(zhì)量控制的檢測指標(biāo)。

Attoui H, Biagini P, Stirling J, Mertens PP, Cantaloube JF, Meyer A, De Micco P, De Lamballerie X. 2001. Sequence characterization of Ndelle virus genome segments 1, 5, 7, 8, and 10: evidence for reassignment to the genus Orthoreovirus, family Reoviridae. Biochemical and Biophysical Research Communication, 287(2): 583-588.

Cashdollar LW, Chmelo RA, Wiener JR, Joklik WK. 1985. Sequences of the S1 genes of the three serotypes of reovirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82(1): 24-28.

Chang JT, Li X, Zhang YL, Yu L. 2008. Isolation and identification of bovine reovirus from feces of the calves suffered from diarrhea. Chinese Journal of preventive Veterinary Medicine, 30(9):711-715. [ 常繼濤, 李鑫,張亞科, 于力. 2008. 犢牛腹瀉糞樣中牛呼腸孤病毒的分離鑒定. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 30(9): 711-715.]

Chua KB, Voon K, Yu M, Keniscope C, Rasid KA, Wang LF. 2011.Investigation of a potential zoonotic transmission of orthoreovirus associated with acute influenza-like illness in an adult patient. PLoS One,6(10): e25434.

Debiasi RL, Edelstein CL, Sherry B, Tyler KL. 2001. Calpain inhibition protects against virus-induced apoptotic myocardia injury. Journal of Virology, 75(1): 351-361.

Huang ZX, Hong T, Sun CB. 1990. Medical Virology Basis, Fundamental Techniques and Methods. Beijing: Science Press, 608-612. [黃禎祥, 洪濤,孫崇柏. 1990. 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù). 北京: 科學(xué)出版社,608-612. ]

Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B,Straus SE. 2001. Fields Virology. 4thed. Philadelphia: Lippincott Willians and Wilkins, 2636-2663.

Koh C, Lesnik R, Brinkmann A, Ebinger A, Radoni? A, Nitsche A,Mühldorfer K, Wibbelt G, Kurth A. 2012. Isolation and characterization of three mammalian orthoroviruses from European Bats. PLoS One, 7(8):e43106.

Leary TP, Erker JC, Chalmers ML, Wetzel JD, Desai SM, Mushahwar IK,Dermody TS. 2002. Detection of reovirus by reverse transcription-polymerase chain reaction usingprimers corresponding to conserved regions of the viral L1genome segment. Journal of Virological Methods, 104(2): 161-165.

London L, Majeski EI, Paintlia MK, Harley RA, London SD. 2003.Respiratory reovirus 1/L induction of diffuse alveolar damage: a model of acute respiratory distress syndrome. Experimental and Molecular Pathology,72(1): 24-36.

Majeski EI, Paintlia MK, Lopez AD, Harley RA, London SD, London L.2003a. Respiratory reovirus 1/L induction of intraluminal fibrosis, a model of bronchiolitis obliterans organizing pneumonia, is dependent on T lymphocytes. American Journal of Pathology, 163(4): 1467-1479.

Majeski EI, Harley RA, Bellum SC, London SD, London L. 2003b.Differential role for T cells in the development of fibrotic lesions associated with reovirus 1/L-induced bronchiolitis obliterans organizing pneumonia versus Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 28(2): 208-217.

McCrae MA, Joklik WK. 1978. The nature of the polypeptide encoded by each of the 10 double-stranded RNA segments of reovirus type 3. Virology,89(2): 578-593.

Sabin AB. 1959. Reoviruses. Science, 130(3386): 1387-1389.

Spinner ML, Di Giovanni GD. 2001. Detection and identification of mammalian reoviruses in surface water by combined cell culture and reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology, 67(7):3016-3020.

Tyler KL, Sokol RJ, Oberhaus SM, Le M, Karrer FM, Narkewicz MR,Tyson RW, Murphy JR, Low R, Brown WR. 1998. Detection of reovirus RNA in hepatobiliary tissues from patients with extrahepatic biliary atresia and choledochal cysts. Hepatology, 27(6): 1475-1482.

Tyler KL, Barton ES, Ibach ML, Robinson C, Campbell JA, Donnell SM,Valyi-Nagy T, Clarke P, Wetzel JD, Dermody TS. 2004. Isolation and molecular characterization of a novel type 3 reovirus from a child with meningitis. Journal of Infectious Diseases, 189(9): 1664-1675.

Tillotson JR, Lemer AM. 1967. Reovirus type 3 associated with fatal pneumonia. The New England Journal of Medicine, 276(19): 1060-1063.

Van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL. 2003. Virus Taxonomy Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego: Academic Press, 84-96.

Zeng ZY, Guo WZ, Xu ZW, Song ZH. 2007. Isolation, identification of porcine reovirus from diarrhea feces of pigs. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 38(6): 574-580. [曾智勇, 郭萬柱, 徐志文, 宋振輝,殷華平, 王新, 王小玉. 仔豬腹瀉糞樣中豬呼腸孤病毒的分離鑒定. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 38(6): 574-580.)

Zou TT, Tan H, He J, Zhu H, Zhang HJ, Song LH, Huang RT, Duan Q. 2003.Cloning and identification of reovirus isolated from specimens of SARS patients. Bulletin of the Academy of Military Medical Sciences, 27(4):241-243. [左庭婷, 檀華, 何君, 朱虹, 張浩杰, 宋立華, 黃如統(tǒng), 端青.2003. 從SARS患者標(biāo)本中分離的呼腸病毒的分離及鑒定. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 27(4): 241-243. ]