趙亞鵬, 潘曉賦, 楊君興,*, 陳小勇,*, 王曉愛, 李再云

1. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室，云南 昆明 650223

2. 中國科學院大學，北京 100049

滇池金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）金線鲃屬（Sinocyclocheilus），分布于滇池流域，為國家二級保護動物，同時，已被列入《中國瀕危動物紅皮書（魚類）》（Yue et al，1998）。自上世紀80年代起，由于環(huán)境污染、棲息地破壞及濫捕濫撈等原因，滇池金線鲃數(shù)量急劇下降（Chen et al，2001）。目前，滇池金線鲃的人工繁殖已經(jīng)成功（Yang et al，2007），并于2009年開始實施人工增殖放流，且放流規(guī)格通常不超過5 cm。一些常規(guī)標志方法，如穿刺標記（percutaneous tags）、可視性植入標記（visible implant tags）及線碼標記（coded wire tags）等易對放流規(guī)格滇池金線鲃造成傷害且成本較高。利用能與鈣結合的化學染料溶液浸泡早期魚苗，從而在耳石上形成相應標志環(huán)的耳石標記法，能夠一次性標記大量早期魚苗，操作簡單，對魚體損傷小，且標記形成后，不會被代謝吸收，理論上能保留終身（van der Walt & Faragher，2003），已被應用于香魚（Plecoglossus altivelis）人工增殖放流（Tsukamoto，1988）及珊瑚魚類的種群生態(tài)學研究（Jones et al，1999）。常用化學染料有：茜素絡合物（alizarin complexone，ALC）、茜素紅（alizarin red S，ARS）及鹽酸四環(huán)素（oxytetracycline，OTC）等，由于對化學染料的耐受性和敏感性不同（Fu et al，2005；Jin et al，2011；Tsukamoto，1988），不同魚種的最佳浸泡條件也不相同。本研究旨在尋找浸泡標記滇池金線仔稚魚的最佳條件，為其早期魚苗的大規(guī)模標記提供技術支持，并為放流后的評估工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源及管理

6日齡（60尾）、20日齡（60尾）及90日齡（80尾）健康滇池金線鲃魚苗均來自中國科學院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地。親本系2005年5～7月采自滇池流域的嵩明縣牧羊河。 6日齡組魚苗投喂蛋黃漿及黃豆?jié){，20日齡組魚苗投喂輪蟲，90日齡魚苗投喂破碎的111鯉魚飼料（顆粒直徑≤0.5 mm，通威股份有限公司昆明分公司）（Pan et al，2009）。

1.2 浸泡溶液配置

實驗采用分析純茜素絡合指示劑（上海冠翔生物技術有限公司，3952-78-1）及茜素紅（上海冠翔生物技術有限公司，130-22-3）。為提高溶解度，先由蒸餾水配置成為500 mg/L的母液，然后用曝氣地下水稀釋至所需濃度。

1.3 實驗方案

兩種化學染料的浸泡液濃度、浸泡時間及樣本大小見表1，表2，各試驗組樣本數(shù)為10尾。實驗期間將樣本置于溫度為16～18 ℃的房間，浸泡實驗開始前 24 h不投餌，浸泡結束更換清水后恢復投餌，暫養(yǎng)一段時間后用丁香油麻醉致死后摘取耳石并觀察。

1.4 耳石摘取及觀察

將樣本魚體置于雙筒解剖鏡下，以解剖針將耳石取出，置于玻片上，清水和酒精清洗及二甲苯透明后，由透明指甲油封存。由于星耳石在仔魚出膜后～30 d出現(xiàn)，矢耳石在出膜30 d后開始呈現(xiàn)狹長生長，90 d后在剝?nèi)r易破碎，故兩者均不宜作為標記檢測載體，而應以微耳石作為檢測對象。光學顯微鏡和熒光顯微鏡（選擇510～560 nm綠色激光作為激發(fā)光）觀察標記效果（Fu et al，2005），且標記效果分為無、可見、清晰及強烈四個等級。

2 結果

2.1 浸泡液安全濃度

茜素紅溶液濃度對仔稚魚的影響結果顯示（表1），濃度50～150 mg/L，浸泡4～36 h條件下，除50 mg/L，4 h實驗組中因操作不當造成1尾死亡外，其他各組均存活率均為100%。當濃度至200 mg/L時，90日齡稚魚出現(xiàn)死亡，24 h和36 h組死亡率分別為30%（n=10）和20%（n=10）。

表1 茜素紅溶液浸泡標記方案及標記效果Table 1 Details of immersion experiments using ARS and their subsequent marking results

茜素絡合物溶液浸泡標記結果顯示（表2），濃度50～100 mg/L，浸泡4～8 h，6日齡仔魚成活率為100%（n=10），當濃度達到150 mg/L時，仔魚開始死亡，浸泡8 h，死亡率達30%（n=10）。為實驗對象時，濃度50～150 mg/L，浸泡12～24 h，對20及90日齡仔稚魚的生存沒有影響，且在該濃度下，浸泡時間延長至3 d，魚苗仍能存活。當濃度＞200 mg/L時，90日齡稚魚全部死亡。

表2 茜素絡合物溶液標記方案及標記效果Table 2 Details of immersion experiments using ALC and their subsequent marking results

2.2 標記效果

2.2.1 茜素紅浸泡效果

可見光下，普通光學顯微鏡觀察茜素紅溶液浸泡標記的滇池金線鲃耳石，可見紫紅色標記環(huán)帶，且標記強度與個體日齡、浸泡濃度及浸泡時間有關。6日齡仔魚，50 mg/L、4 h實驗組可觀察到可辨識微弱標記環(huán)，100及150 mg/L試驗組均能形成清晰標記環(huán)。20日齡仔魚，50 mg/L、12 h試驗組未見標記環(huán)，50 mg/L、2 h及100 mg/L，12 h實驗組僅見微弱標記環(huán)，150 mg/L、24 h試驗組標志環(huán)顏色最為強烈（圖A，B）。90日齡稚魚，50 mg/L未見標志環(huán)，100～200 mg/L可見標記環(huán)。熒光顯微鏡（綠色激發(fā)光）觀察，各實驗組均可見猩紅色熒光反應，且標記個體日齡越小、浸泡濃度越大及浸泡時間越長，其顏色越強烈。

圖1 茜素紅各類標記方案對仔魚微耳石的標記效果Figure 1 Marking results of immersion experiments using ARS

圖2 茜素絡合物對仔魚微耳石的標記效果Figure 1 Marking results of immersion using ALC

2.2.2 茜素絡合物浸泡效果

可見光下，普通光學顯微鏡觀察結果顯示，茜素絡合物溶液浸泡標記的仔稚魚耳石呈現(xiàn)與茜素紅相同的紫紅色標記環(huán)，且相對于茜素紅，滇池金線鲃仔稚魚對茜素絡合物溶液更加敏感。6日齡仔魚，50 mg/L，4 h實驗組可見清晰標記環(huán)。20日齡和90日齡魚苗，50～150 mg/L實驗組均可見紫紅色標記環(huán)。熒光顯微鏡下（510～560 nm綠色激發(fā)光），各實驗組標記帶均呈猩紅色銀光熒光反應。

3 討論

3.1 檢測條件

可見光及綠色激光下均能觀察到茜素紅和茜素絡合物在耳石上所形成的標記環(huán)。綠色激光下，標記環(huán)內(nèi)部區(qū)域呈猩紅色，與浸泡標記后生長的耳石部分形成強烈對比，可見光下，僅能觀察到深紅色的標記環(huán)；綠色激光下，不能觀察到耳石的生長輪，可見光下，可觀察到標記環(huán)前后形成的生長輪；形成可見光下可被觀察到的標記環(huán)所需的浸泡強度高于綠色激光。因此，可見光檢測的方法更適用于耳石生長輪生長規(guī)律的研究，而綠色激光檢測方法更適用于放流標記。

3.2 浸泡條件及化學染料

浸泡濃度和浸泡時間均可影響標記效果。相同浸泡濃度下，浸泡時間越長，效果越好，同時，為提高標記效率，浸泡時間不宜過長。6日齡仔魚，浸泡時間以8 h為宜，20 和90日齡魚苗浸泡時間以24 h為宜。在安全濃度范圍內(nèi)，浸泡液濃度越高，標記效果越好。為使在可見光下標記效果達到清晰易于辨認的級別，標記6日齡仔魚時，茜素紅和茜素絡合物的浸泡液濃度需達到50 mg/L；標記20日齡仔魚時，兩種浸泡液濃度要分別達到 100 mg/L和50 mg/L；標記90日齡稚魚時，濃度要分別達到150 mg/L和100 mg/L。而在綠色激光下，50 mg/L的茜素紅和茜素絡合物溶液浸泡6、20及90日齡魚苗，便可見清晰標記，且以上浸泡條件均不影響仔魚生存。若以放流標記為目的，50 mg/L為茜素紅和茜素絡合物溶液的合適濃度，而不超過20日齡的魚苗，還可適當降低浸泡濃度。相同濃度下，茜素絡合物標記效果優(yōu)于茜素紅，但茜素紅更具價格優(yōu)勢，綜合考慮茜素紅為標記滇池金線鲃的最佳化學染料。

3.3 標記規(guī)格

Secor et al（1991）認為, 不同魚齡個體之間標記效果的差異也許和代謝速率有關，低齡魚代謝率高于高齡魚，更易吸收化學染料并形成標記。滇池金線鲃標記試驗中，個體越小，越易形成標記環(huán)。相同浸泡強度下，20日齡仔魚耳石標記效果優(yōu)于90日齡稚魚。個體越小，浸泡標記期間的飼養(yǎng)密度就越大，6日齡仔魚飼養(yǎng)密度遠高于90日齡稚魚，大大提高了熒光染料的利用率。因此，從標記效果、浸泡效率及熒光染料利用率等方面來看，相較 20及90日齡仔稚魚，6日齡仔魚更適宜于標記放流。

綜上所述，茜素紅和茜素絡合物均適用于滇池金線鲃仔稚魚耳石標記，但茜素紅更具價格優(yōu)勢，更適用于大規(guī)模標記放流。浸泡標記時，標記環(huán)大小取決于浸泡時仔稚魚耳石的大小，通過標記不同日齡仔稚魚來控制標記環(huán)的大小，從而區(qū)分不同的放流群體，是今后的研究重點之一。

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