劉輝輝 肖丹 鄭曉 顧巖 郭善禹

創(chuàng)面愈合是外科領(lǐng)域中的重要問題，糖尿病、截癱、局部放射線損傷等所致的創(chuàng)面難以愈合[1-2]。促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方法包括清創(chuàng)、應(yīng)用抗生素、組織移植和應(yīng)用生長(zhǎng)因子等。中草藥因療效確切、適應(yīng)證廣泛、價(jià)廉、使用方便等特點(diǎn)，至今仍被廣泛使用。許多中草藥已被證明具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功能[3-4]。龍血竭（Resina Draconis）為劍葉龍血樹樹干產(chǎn)生的紅色樹脂，多用于活血化瘀、消炎止痛等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍血竭具有良好的活血化瘀、抗栓、抗氧化、抗菌消炎等生理活性[5-6]。近年來，臨床應(yīng)用龍血竭治療難愈性創(chuàng)面，具有良好的療效。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用乙醇提取法制備龍血竭提取物，并作用于大鼠創(chuàng)面，為探討龍血竭促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生物學(xué)機(jī)制，提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器與試劑

SD大鼠48只，體質(zhì)量170～200 g，雄性，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；龍血竭由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科提供；CD31單克隆抗體（Epitomics公司）；VEGF 單克隆抗體 （Epitomics公司）；Trizol（Invitrogen公司）；SYBR Green熒光定量試劑盒（Takara 公 司）；Stratagene Mx3000P （Stratagene 公司）；Image Pro Plus軟件（Media Cybernnetics公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物提取與植物成分化學(xué)分析

龍血竭100 g，用95%乙醇浸泡 48 h，過濾，收集乙醇液，過濾并蒸餾回收乙醇，得干燥紅色結(jié)晶，即為龍血竭提取物。龍血竭提取物軟膏由5 g提取物與100 g凡士林混勻而成。

植物化學(xué)成分定性分析參考Harborne和Kokate等方法[7]，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乙醇提取物中有黃酮類、強(qiáng)心苷類、三萜類、酚類、生物堿類和皂甙類化合物。

1.2.2 動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)分組

將健康成年48只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、濕潤(rùn)燒傷膏組 （MEBO組）、龍血竭乙醇提取物組（RDEE組）3組，每組16只。將各組大鼠腹腔注射麻醉，剃去背部毛發(fā)后于大鼠背部中上作一直徑為1.8 cm的圓形全層皮膚創(chuàng)面，將凡士林、MEBO和RDEE軟膏涂于無菌紗布上，面積與創(chuàng)面相當(dāng)，覆蓋于創(chuàng)面并包扎。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，隔日換藥，自由飲食。

1.3 結(jié)果檢測(cè)

1.3.1 創(chuàng)面愈合率與愈合時(shí)間

于大鼠傷后3 d、7 d、11 d和15 d，肉眼觀察，記錄創(chuàng)面愈合情況。數(shù)碼相機(jī)拍照，Image Pro Plus軟件分析，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。觀察創(chuàng)面愈合情況，以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.3.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

于術(shù)后 3 d、7 d、11 d、15 d 各組取 3 只大鼠的創(chuàng)面組織。將創(chuàng)面組織用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片 （厚度 4 μm），HE、Masson染色，光鏡下觀察組織炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞、新生血管和肉芽組織等[9]。

1.3.3 CD31免疫組化染色與創(chuàng)面微血管密度（MVD）計(jì)算

石蠟切片于70℃恒溫箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。室溫下滴加0.3%過氧化氫甲醛溶液，10 min后PBS洗滌3次。0.1%胰蛋白酶37℃，30 min，PBS洗滌 3次。 DAB 室溫 30 min，甩干。滴加一抗CD31，1∶500稀釋，4℃過夜。PBS洗滌3 次。滴加二抗（anti-Rabbit）37 ℃，30 min。PBS 洗滌3次，顯色5 min，并用PBS充分沖洗。蘇木素復(fù)染1 min，自來水充分沖洗 30 min。梯度乙醇脫水、二甲苯透明。中性樹脂封片并加蓋玻片，自然晾干。

創(chuàng)面微血管密度（MVD）計(jì)算，每張切片光鏡下觀察，胞質(zhì)呈棕黃色者為CD31表達(dá)陽性細(xì)胞，以CD31表達(dá)陽性細(xì)胞或細(xì)胞簇作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)單位，在低倍鏡（40×）下選擇微血管密度最高的3個(gè)區(qū)域，于高倍鏡（200×）下計(jì)數(shù)3個(gè)視野的MVD，取其平均數(shù)為該標(biāo)本的MVD[10]。

1.3.4 創(chuàng)面肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)檢測(cè)

使用Trizol試劑盒抽提組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green熒光定量試劑盒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列，VEGF forward：5'-CACCA AAGCAGCACATAGGAGA-3'，reverse：5'-TTACAC GTCTGCGGATCTTGGACA-3'；GAPDH forward：5'-GAACGGGAAGCTCACTGGC-3'，reverse：5'-GCATG TCAGATCCACAACGG-3'。擴(kuò)增條件為 95 ℃，30 sec；60℃，30 sec， 共 40循環(huán)，72℃，5 min。 以 GAPDH為內(nèi)參，Stratagene Mx3000P進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR分析，每個(gè)樣品重復(fù)3管。

1.3.5 Western Blot分析VEGF的表達(dá)

組織勻漿后用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度。10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，37℃封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜（VEGF，1∶200），以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光X線片顯影，GAPDH作為內(nèi)參。用ImagePro Plus 6.0軟件分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間

術(shù)后第 3、7、11、15 天 MEBO 和 RDEE 組創(chuàng)面愈合率均高于對(duì)照組 （P<0.05），MEBO組和RDEE組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。對(duì)照組、MEBO組和RDEE組的創(chuàng)面平均愈合時(shí)間分別為 （18.67±0.82） d、（14.16±0.75） d 和（15.12±0.75） d，MEBO 組和RDEE組愈合時(shí)間與對(duì)照組相比約提前3.5 d，有顯著差異 （P<0.05），MEBO組和RDEE組相比無明顯差異。

圖1 各組創(chuàng)面愈合率比較Fig.1 Comparison of healing rate in control,MEBO and RDEE group(**:versus control group,P<0.01)

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色顯示，三組均可觀察到創(chuàng)面愈合過程中肉芽組織的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，MEBO組和RDEE組可觀察到較多的成纖維細(xì)胞、新生血管和較少的炎性細(xì)胞，與對(duì)照組有明顯差異。Masson染色顯示，MEBO組和RDEE組比對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞和新生膠原較多、膠原排列有序（圖2）。

圖2 術(shù)后7天各組組織形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Histological observation of each group 7 days after treatment by HE and Masson staining

圖3 術(shù)后7天各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Histochemical observation of each group 7 days after treatment

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)和微血管密度

新生血管形成伴隨創(chuàng)面愈合全過程。CD31為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物之一。免疫組化染色顯示，MEBO組和RDEE組CD31陽性率較高，與對(duì)照組有明顯差異（圖3）。傷后7 d時(shí)，三組MVD均呈上升趨勢(shì)，MEBO組和RDEE組在術(shù)后第11天達(dá)高峰，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）（表 1）。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)MVD的比較Table 1 The comparison of MVD in each group at different time point

2.4 創(chuàng)面組織VEGF表達(dá)量的檢測(cè)

VEGF是一種對(duì)血管生成有極強(qiáng)誘導(dǎo)作用的多功能誘導(dǎo)因子，是已知促血管生成最強(qiáng)的細(xì)胞因子。RDEE組VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組 （P<0.05），MEBO組VEGF mRNA的表達(dá)也明顯高于對(duì)照組（P<0.05）（圖 4，5）。

圖4 術(shù)后第7天各組VEGF mRNA的表達(dá)Fig.4 VEGF mRNA expression in each group(**:versus control,P<0.01)

圖5 術(shù)后7天各組VEGF蛋白表達(dá)Fig.5 VEGF expression in each group by western blot(*:versus control,P<0.05)

3 討論

創(chuàng)面愈合是外科領(lǐng)域的重要問題，是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物過程[11]，主要包括細(xì)胞趨化、結(jié)締組織細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積及重排、上皮細(xì)胞遷移與增生，最終導(dǎo)致創(chuàng)面再上皮化，恢復(fù)組織的完整性和連續(xù)性。皮膚結(jié)構(gòu)一旦遭到破壞，組織修復(fù)程序開始啟動(dòng)進(jìn)行快速有效的修復(fù)[12]。傳統(tǒng)理論上將創(chuàng)面愈合人為劃分為三個(gè)重疊有序的階段，即：炎癥反應(yīng)階段、組織細(xì)胞增生階段和組織重塑階段。創(chuàng)面再上皮化、創(chuàng)面膠原的沉積和創(chuàng)面血管的新生是創(chuàng)面愈合主要的特征。三者的發(fā)生發(fā)展相輔相成，又互為條件的。

創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間是最直接而有效的創(chuàng)面愈合評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠背部圓形皮膚切除模型證實(shí)，使用龍血竭乙醇提取物軟膏能有效提高創(chuàng)面愈合率和降低創(chuàng)面愈合時(shí)間，與對(duì)照組相比創(chuàng)面平均愈合時(shí)間縮短3.5 d。

膠原沉積增加和新生血管增多有利于促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[13]。膠原代謝在創(chuàng)面愈合中占據(jù)重要地位，是構(gòu)成修復(fù)組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分，為創(chuàng)面修復(fù)過程中，組織血管化和上皮化提供支架，對(duì)于修復(fù)過程的完成有著極其重要的作用。創(chuàng)面愈合過程中，膠原代謝的情況反映了創(chuàng)面愈合的情況[14]。創(chuàng)面新生血管發(fā)生于傷后即刻，新生的血管為創(chuàng)傷部位提供氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，并能促進(jìn)肉芽組織的生長(zhǎng)，對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)具有重要作用。微血管的數(shù)量關(guān)系到組織修復(fù)能否得到充足的血流和氧供，若創(chuàng)面有相對(duì)足夠的新生血管形成[15]，創(chuàng)面組織將得到充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧，創(chuàng)面愈合速度將得到加快。本實(shí)驗(yàn)中，HE染色顯示RDEE組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少、微血管較多，與對(duì)照組有明顯差異；Masson染色顯示RDEE組成纖維細(xì)胞數(shù)量多，膠原排列有序，相對(duì)膠原含量明顯高于對(duì)照組；MEBO組和RDEE組的MVD逐漸升高，于第11天達(dá)到高峰；在第3、7、11天，RDEE組MVD都明顯高于對(duì)照組。

此外，許多類型的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子與創(chuàng)面愈合過程中的肉芽組織形成、新生血管形成和再上皮化等過程有著密切的聯(lián)系[16]，其中VEGF已被證實(shí)是唯一對(duì)血管形成具有特異性的生長(zhǎng)因子。VEGF參與了創(chuàng)面愈合的各個(gè)階段，不僅能夠引起細(xì)胞外基質(zhì)成分改變、誘導(dǎo)新生血管形成、減少瘢痕組織的產(chǎn)生和減少感染的發(fā)生[17-18]，還可增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌，從而加速創(chuàng)面愈合[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RDEE組VEGF表達(dá)明顯高于對(duì)照組。

龍血竭為治療皮膚瘡瘍和創(chuàng)傷的常用藥物，具有活血化瘀、去腐生肌、收斂止血等雙向調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍血竭具有良好的活血化瘀、抗氧化、抗菌消炎的生理活性[20-21]。植物藥學(xué)成分分析表明，龍血竭乙醇提取物含有黃酮類、三萜類、生物堿類、酚類等化合物。黃酮類和三萜類等植物化學(xué)成分已被證實(shí)具有抗菌、收斂、抗氧化等作用[22]。因此，對(duì)龍血竭提取物有效成分的分離與研究仍需進(jìn)一步深入。

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