靳 鈺，劉永安，臧遠(yuǎn)勝，修清玉

(第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200003)

哮喘(asthma)是臨床常見具有臨床易感性的慢性呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病。接觸過敏原后IgE增高，結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，觸發(fā)迅速而強(qiáng)烈的氣道炎癥反應(yīng)［1］。目前CD4+T細(xì)胞極化時Ⅰ型和Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th1和Th2細(xì)胞)兩者比例失調(diào)［2］成為研究哮喘發(fā)病的重點。CD4+T淋巴細(xì)胞通過“雙信號”實現(xiàn)細(xì)胞活化:第一信號TCR-抗原肽-MHCⅡ和第二信號共刺激受體［3］。共刺激受體分為正向和負(fù)向刺激受體，協(xié)助第一信號影響細(xì)胞活化，維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。目前負(fù)向共刺激受體有CTLA-4、PD-1、BLTA、TIM-3 等［4］。CTLA-4 和 PD-1可負(fù)調(diào)控免疫及炎癥反應(yīng)［5-7］。新近發(fā)現(xiàn)同CTLA-4、PD-1結(jié)構(gòu)相似的BLTA免疫球蛋白超家族成員，可結(jié)合HVEM配體的負(fù)向共刺激受體。Yee發(fā)現(xiàn)BLTA基因敲除小鼠特異性抗體應(yīng)答增強(qiáng)［8］，Deppong研究發(fā)現(xiàn)卵蛋白致敏小鼠可見氣道炎癥細(xì)胞浸潤持續(xù)時間延長［9］。負(fù)向刺激受體BTLA能夠抑制免疫應(yīng)答控制炎癥，但BLTA在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制未明。本實驗觀察急性哮喘模型中BTLA的表達(dá)特點及地塞米松對其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 4～5周齡BALB/C6清潔級雌性小鼠18只，購買自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心(SPF)。主要試劑:OVA(V級，Sigma公司)，Aluminum(Sigma公司)，小鼠IL-4和IFN-γELISA試劑盒(R＆D公司)，PF anti-mouse BLTA抗體(Biolegend)和 FITC anti-mouse CD4+抗體(Biolegend)，淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為公司)。試驗時間2013年1月18日。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及哮喘模型建立［10］按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、急性哮喘模型組和地塞米松治療組，致敏用含20μg卵蛋白(OVA，V級，美國Sigma公司)和2 mg AL(OH)3(Sigma公司)的0.2 ml生理鹽水;對照組僅給0.2ml含2mg AL(OH)3的生理鹽水，分別第1和8天腹腔注射(i.p.);第21天激發(fā)，將致敏小鼠放入霧化箱(自制)，用超聲霧化器(中國江蘇魚躍牌，402AI)激發(fā)小鼠誘發(fā)哮喘，霧化OVA濃度為2.5%，30分鐘，每天1次，連續(xù)3天;地塞米松組每次激發(fā)前30 min給予地塞米松(i.p.10 mg/kg);對照組為生理鹽水霧化。

1.2.2 標(biāo)本采集和處理末次霧化后48 h斷頸處死小鼠75%乙醇浸泡，超凈臺中取脾臟;肺臟浸泡至4%中性福爾馬林溶液，24 h后組織性石蠟包埋切片;眼球取血于1.5 ml凍存管中，4℃離心機(jī)2000 rpm，取血清，參照ELisa試劑盒說明檢測血清IL-4和 IFN-γ。

1.2.3 CD4+T淋巴細(xì)胞BTLA檢測 脾臟原代淋巴細(xì)胞制備 超凈臺中取脾臟放在覆蓋已消毒的200目無菌尼龍網(wǎng)的6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中放5 m l淋巴細(xì)胞分離液，10ml無菌注射器內(nèi)活塞研磨脾臟2～3 min，收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞;將培養(yǎng)皿中細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，上層覆蓋500μl 1640培養(yǎng)基;室溫800 g離心30 min后，吸出淋巴細(xì)胞，10 ml 1640培養(yǎng)基洗滌，250 g離心10 min，收集細(xì)胞，用貼壁法除去單核/巨噬細(xì)胞后，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至5×106。標(biāo)記細(xì)胞表面分子:淋巴細(xì)胞懸液200μl中加1μl PE標(biāo)記鼠抗BTLA抗體(Biolegend)和1μl FITC標(biāo)記鼠抗 CD4抗體(Biolegend)，4℃避光孵育1小時，2500 rpm離心5 min，500μl PBS洗滌2次。上述細(xì)胞制備完成后，流式細(xì)胞儀檢測 CD4+T淋巴細(xì)胞表面 BTLA，通過FLOWJO(7.6)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)結(jié)合SNK-q檢驗或t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型建模鑒定

2.1.1 一般情況 正常組小鼠活動正常，無頻繁撓皮膚四肢現(xiàn)象，呼吸平穩(wěn);哮喘小鼠霧化吸入OVA后呼吸急促、躁動不安，大小便失禁，霧化后期小鼠活動減少;地塞米松組小鼠呼吸頻率增加，撓皮膚及四肢可見，但癥狀較哮喘組少。

2.1.2 血清IL-4和IFN-γ檢測 血清IL-4在哮喘組最高，對照組最低，地塞米松治療組介于兩者之間;血清IFN-γ在對照組最高，哮喘組最低，地塞米松治療組介于兩者之間，見表1。

表1 Elisa檢測血清中IL-4和IFN-γ濃度變化 (pg/ml)

2.1.3 肺組織病理學(xué)檢查 經(jīng)卵蛋白致敏后，急性哮喘小鼠模型肉眼可見肺部體積增大，鏡下支氣管周圍可見EOS浸潤，部分肺泡間隔融合成肺氣腫，肺間質(zhì)可見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，上皮下可見杯狀細(xì)胞增生;對照組未見明顯異常(圖1，HE×200)。糖皮質(zhì)激素組仍可見炎癥細(xì)胞浸潤，較哮喘組嗜酸細(xì)胞減少，但比對照組明顯。

圖1 肺組織病理學(xué)檢查 a:對照組;b:哮喘組;c:地塞米松組

2.2 BTLA在急性哮喘模型CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá) BTLA在急性哮喘模型組CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)較空白對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.299，P ＜ 0.01)，見圖2。

2.3 地塞米松上調(diào)BTLA在CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá) 地塞米松治療組急性哮喘模型CD4+T淋巴細(xì)胞表面BTLA表達(dá)上調(diào)(哮喘組VS對照組，地塞米松組VS對照組，P＜0.01;哮喘組VS地塞米松組，P＜0.05)，見圖3。BTLA在非CD4+T淋巴細(xì)胞表面地塞米松治療組與哮喘組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖4。

圖2 BTLA在哮喘模型CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá) a:對照組;b:哮喘組

圖3 BLTA在CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)

圖4 BLTA在非CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)

3 討論

支氣管哮喘以氣道大量炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)浸潤以及細(xì)胞組分參與，t同時伴氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞的慢性氣道炎癥。哮喘發(fā)病時喘息氣急、胸悶或咳嗽為臨床癥狀［1］。其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳基因、免疫應(yīng)答以及環(huán)境等因素，雖然近幾年從基因到分子水平有大量研究，但哮喘機(jī)制仍未完全闡明。當(dāng)機(jī)體接觸過敏原，刺激并激活T細(xì)胞，使T細(xì)胞分化增值。目前T細(xì)胞分化時Th0細(xì)胞極化偏向Th2為目前較為明確的哮喘發(fā)病機(jī)制之一。T細(xì)胞表面受體可調(diào)控T細(xì)胞活化增殖，與Th1/Th2比例失調(diào)有一定相關(guān)關(guān)系。T細(xì)胞活化時第二信號(共刺激受體)可協(xié)助第一信號促發(fā)下游信號，調(diào)控T細(xì)胞活化［4］。CTLA-4和PD-1作為經(jīng)典負(fù)向共刺激受體參與負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答，CTLA-4Ig可有效抑制過敏所致氣道炎癥［11］。近期研究發(fā)現(xiàn) BTLA/HVEM通路同樣可調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制T細(xì)胞增殖［12］，BTLA基因敲除促使T細(xì)胞增殖及活化增加［13，14］。BTLA可抑制T細(xì)胞活化或促使細(xì)胞凋亡，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，地塞米松促使CD4+T淋巴細(xì)胞表面BTLA表達(dá)上調(diào)，加強(qiáng)負(fù)性共刺激受體對T細(xì)胞免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控，降低免疫反應(yīng)。

BTLA敗血癥小鼠炎癥細(xì)胞活化增多［15］，BTLA缺陷導(dǎo)致過敏小鼠致氣道炎癥高峰推遲及持續(xù)時間延長［9］。PD-1小鼠抗炎癥因子及其前體均受抑制［16］，影響范圍較廣;而BTLA僅影響IL-10釋放來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［15］，BTLA較PD-1能夠更為精準(zhǔn)控制炎癥發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘模型中活化CD4+T淋巴細(xì)胞BTLA表達(dá)增高，提示BTLA可抑制氣道炎癥并縮短氣道炎癥作用時間，防止炎癥反應(yīng)過強(qiáng)而導(dǎo)致的周邊組織形成病理性損傷。

糖皮質(zhì)激素的抗炎作用可有效控制哮喘發(fā)作，抑制哮喘發(fā)病中活化炎癥相關(guān)基因表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用，是目前治療哮喘一線用藥。那么地塞米松是否能通過BTLA的表達(dá)參與氣道炎癥反應(yīng)的調(diào)控呢?本實驗中急性哮喘模型給予地塞米松，CD4+T淋巴細(xì)胞BTLA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，同時HE觀察可見氣道炎癥細(xì)胞浸潤改善。地塞米松可促使活化CD4+T淋巴細(xì)胞表面BTLA上調(diào)，從而增強(qiáng)其對氣道炎癥的抑制作用，可能是地塞米松在哮喘急性發(fā)作期迅速起效的作用機(jī)制之一。

本研究結(jié)果顯示，急性哮喘模型CD4+T淋巴細(xì)胞BTLA明顯升高，CD4+T淋巴細(xì)胞表面BTLA表達(dá)與哮喘發(fā)病有一定相關(guān)性。地塞米松可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞BTLA表達(dá)，通過BTLA抑制氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。地塞米松BTLA表達(dá)的上調(diào)作用為哮喘研究及治療提供新的研究方向。

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