周雨田,徐 軍
(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院干部科老年疾病研究所呼吸病房,四川 成都 610072;2.廣州醫(yī)學院廣州呼吸疾病研究所國家重點試驗室,廣東 廣州510120)
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性變態(tài)反應性疾病,以氣道高反應性(airway hyperresponsivenes,AHR)為特點。過量表達的炎癥因子內皮素(endothelin-1,ET-1)在引起哮喘變應性氣道炎癥及氣道高反應性的過程中起著重要的作用[1],最終導致肺功能的損害。我們既往的研究提示12-烷基化殼聚糖納米粒(12-ACSs)包裹的反義ECE核酸納米載體能夠成功地在體外氣道上皮細胞表達目標核酸,發(fā)揮RNA干擾效應,減少變應原誘導的ET-1的過度生成[2]。本實驗進一步探討經過12-烷基化殼聚糖納米粒(12-ACSs)包裹的反義內皮素轉換酶(ECE)核酸表達質粒治療后,在炎癥因子內皮素減少的情況下,能否對哮喘模型小鼠肺功能構成影響。
1.1 實驗動物 健康雌性Balb/c小鼠數量40只,6~8周齡,體重18~22 g,SPF級,購自中山醫(yī)科大學動物房。
1.2 主要試劑和儀器 12-ACSs由天津大學材料學院劉文廣教授惠贈。小鼠 IL-13和IFN-γELISA試劑盒(比利時 Biosource公司),小鼠 Endothelin(ET)ELISA試劑盒(美國Cayman公司),小鼠IL-4 ELISA試劑盒(比利時Biosource公司),酶標儀(芬蘭Labsystem公司)。pEGFPN2-反義ECE表達質粒(本研究所構建),OVA購自美國Sigma公司,辣根過氧化物酶(HRP)藕聯的羊抗鼠抗體(二抗IgG)、HRP藕聯的抗生物素抗體購自美國Oncogene公司,乙酰甲膽堿(methacholine,Mch)購自Sigma公司,美國Buxco小鼠肺功能儀。
1.3 12-ACSs的制備 將烷基化殼聚糖與pEGFPN2-反義ECE表達質粒按質量比2∶1制備包裹反義ECE核酸的12-ACSs納米粒。0.4μm孔徑濾器過濾除菌。
1.4 變應性氣道炎癥模型的建立和處理 將40只小鼠按完全隨機設計分為4組,每組10只。N組僅給予生理鹽水致敏、激發(fā)并治療;NM組予OVA致敏、激發(fā)并給予包裹反義ECE核酸的12-ACSs治療;AS組為OVA致敏、激發(fā)后給予生理鹽水治療的氣道炎癥模型組;DNA組為OVA致敏、激發(fā)并給予裸反義ECE核酸治療組。NM組、As組、DNA組于于第0天與第14天每只小鼠分別腹腔注射OVA致敏液0.2 m1,于第 24、25、26 天,以 1%OVA 溶液 8 m l霧化吸入,35 min/(次·天)。N組分別給予相同體積的生理鹽水腹腔注射及霧化吸入。NM組、As組和DNA組于首次激發(fā)前24小時分別通過氣道灌注包裹反義ECE核酸的12-ACSs(含反義ECE核酸5 μg)100 μl、0.9%生理鹽水 100 μl和反義ECE 核酸5μg加 0.9%生理鹽水(總量 100μl),N組用等體積0.9%生理鹽水處理。
1.5 支氣管肺泡灌洗 小鼠分組及處理同前,小鼠摘眼球放血后處死,氣管插管,肺泡灌洗PBS 0.8ml×3次。灌洗液離心1500 r/min×10min,細胞沉淀制備細胞涂片。光學顯微鏡下進行細胞分類計數。
1.6 肺組織病理檢查 小鼠分組及處理同前,小鼠摘眼球放血后頸椎脫臼處死,開胸取右肺組織,常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。
1.7 ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清液細胞因子小鼠分組及處理同前,無菌分離脾細胞,以MEM完全培養(yǎng)基調整脾細胞濃度至2×106/ml,以1 ml/孔體積接種于24孔板,加OVA(終濃度500 mg/L)刺激的條件下,于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)72 h,離心收取培養(yǎng)液上清液,-20℃保存待測。
1.8 增強呼氣間歇(enhanced pause,Penh)的檢測末次激發(fā)后48 h,用Buxco小鼠無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠的Penh的變化,設定Mch激發(fā)濃度依次為0、3.12、6.25、12.5、25 和 50 g/L,記錄 Penh 平均值。以生理鹽水刺激時的Penh為基值,將各Penh的與生理鹽水激發(fā)時的Penh值的百分比(Penh/NS%)作為氣道反應性統(tǒng)計指標,以Penh%表示,作為小鼠氣道反應性的評價指標。
1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0軟件。對各組數據(以均數±標準差表示)先進行正態(tài)檢驗和單因素方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布的數據組間比較采用單因素方差分析,有統(tǒng)計學意義時采用LSD法行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 支氣管肺泡灌洗液細胞學檢查 與N組相比,As組、DNA組和NM組細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比與絕對計數均增高。而治療后NM組上述三種指標均顯著低于As組和DNA組小鼠,見表1。
表1 各組支氣管肺泡灌洗液細胞計數及所占比例
2.2 小鼠肺病理改變 As和DNA組小鼠支氣管、細支氣管上皮下和小血管可見嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤,氣道上皮結構紊亂,部分脫落,管腔內滲出增加,上皮下充血水腫明顯,亦可見炎性細胞浸潤。N組小鼠與其他3組比較,肺泡結構清晰,纖毛上皮整齊,無炎性細胞的浸潤及充血水腫。NM組肺部炎癥改變較As組和DNA組有所減輕(圖1)。
圖1 肺病理改變(HE染色,400×)a.N 組,b.As組,c.NM 組,d.DNA 組
2.3 脾細胞培養(yǎng)上清液細胞因子檢測結果 脾細胞培養(yǎng)上清液N組ET水平均明顯低于NM組、As組和DNA組(均P<0.001),而NM組ET水平則明顯低于As組和DNA組(均P<0.001),As組和DNA組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.051),IL-4結果與ET相似,見表2。
表2 各組小鼠脾細胞OVA刺激培養(yǎng)上清液細胞因子的含量 (ng/L)
2.4 各組小鼠氣道反應性 在各濃度MCh激發(fā)下,As、NM、DNA組較N組小鼠氣道氣道反應性明顯增高,而NM組氣道阻力較As及DNA組明顯降低(圖2)。
圖2 各組小鼠氣道功能
在既往的研究中,我們制備的12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達質粒納米粒通過活體動物氣道滴注,顯示其可以成功地在活體動物表達,減少ET的生成[3]。我們的實驗結果顯示:與對照組比較,其余各組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液中ET水平均顯著升高,而NM組小鼠肺勻漿上清中,ET水平明顯低于 As和DNA組,表明12-ACSs包裹的反義ECE質粒能夠成功在小鼠氣道表達,減少了內皮素的生成,國外有研究發(fā)現ET有促進IL-4,IL-5和IL-13分泌的作用,使用ET受體拮抗劑可以阻斷該作用[4],我們的結果發(fā)現炎癥細胞因子IL-4的水平亦相應明顯下降。作為Th2亞群的代表性細胞因子,IL-4能刺激B細胞的增殖和分化以及合成和分泌IgE,促進肥大細胞的生長,誘導淋巴細胞的粘附和嗜酸粒細胞的趨化。它還能促進粘蛋白的基因表達和杯狀細胞化生。此外,IL-4還是T細胞自身分泌的生長因子,能夠誘導T細胞向Th2型分化,誘導哮喘的發(fā)生[5]。從上述研究結果可以看出:通過12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達質粒納米粒的治療,減少了ET及IL-4這些炎癥細胞因子的生成,從而達到減輕哮喘氣道炎癥的目的。
在上述結果基礎上,我們進一步研究該納米粒是否能對減輕哮喘的氣道高反應性。支氣管哮喘作為一種慢性氣道炎癥性疾病,氣道高反應性是哮喘患者產生癥狀的主要原因。本實驗12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達質粒納米粒治療后發(fā)現其對小鼠支氣管哮喘的發(fā)生具有明顯的保護作用。內皮素減少后可明顯降低支氣管灌洗液中細胞數,降低脾細胞培養(yǎng)液中內皮素、IL-4水平,病理切片也說明12-ACSs包裹的pEGFPN2-反義ECE表達質粒納米粒可以減少炎癥細胞的浸潤,減少氣道分泌物的滲出,從而降低氣道炎癥,由此我們推測氣道炎癥降低后可緩解氣道高反應性,我們的實驗結果證實了這一點:NM組的氣道高反應性明顯低于As組和DNA組。氣道高反應性是哮喘的特征性表現,其具體調節(jié)機制尚不完全清楚,但已有的研究表明氣道高反應性和氣道炎癥密切相關[6]。本研究的結果提示由于反義ECE質粒納米粒導致的ET的生成減少,可以減輕哮喘氣道炎癥及相關的氣道高反應性。
綜上所述,給予哮喘模型小鼠氣道內添加12-ACSs包裹的反義ECE質粒納米粒治療,可以減少ET、IL-4等炎癥介質的生成,抑制炎癥細胞在氣道的聚集,繼而達到減輕氣道高反應性的目的,因此,12-ACSs包裹的反義ECE質粒治療方法有可能發(fā)展成為支氣管哮喘新的治療策略。
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[3]周雨田,徐軍.12-烷基化殼聚糖納米粒包裹反義內皮素轉換酶核酸表達質粒在哮喘基因治療中的特征[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(5):830-833.
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