鐘振東，傅 榮，游曉波，魯 峰

(1.四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院a.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，b.整形外科，四川 成都 610072;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510515)

雖然組織工程已經(jīng)發(fā)展了近20年［1，2］，許多工程化組織和器官已經(jīng)出現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有些已經(jīng)用于臨床。然而，應(yīng)用脂肪細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)軟組織缺損近期才引起學(xué)者們的關(guān)注［3～5］。雖然脂肪組織工程的方案還未到能夠應(yīng)用于臨床階段，但是已經(jīng)有體內(nèi)研究的證據(jù)［6～9］。2010～2012年四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院與南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院通過將細(xì)胞和Ⅰ型膠原支架材料復(fù)合培養(yǎng)，移植裸鼠皮下，探討構(gòu)建工程化脂肪組織的適宜方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:42只出生4～6周的裸鼠(品系為BALB/c，體重18～23 g)。主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，德國(guó));液氮罐(CBS，美國(guó));離心機(jī)(Heraeus，德國(guó));倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。主要試劑:DMEM、胎牛血清由 Gibco公司生產(chǎn);I型膠原酶、胰蛋白酶、I型膠原支架材料、四氮唑復(fù)合物(XTT)，硫酸酚嗪甲酯和二甲基亞砜均購(gòu)自 Sigma，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自 Corning。

1.2 脂肪組織來源的脂肪干細(xì)胞(ADSCS) 原代、傳代培養(yǎng)取人吸脂術(shù)中吸出的脂質(zhì)部分，用緩沖液反復(fù)沖洗，剪刀剪碎。0.1%膠原酶37℃消化40 min，期間需反復(fù)震蕩混勻1次，使用等量體積的完全培養(yǎng)基中和后，離心1200 g×5 min，去上清，沉淀混懸后使用肽盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性，加入10%DMEM培養(yǎng)基中，37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%即可傳代，取第3～4代細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。

1.3 細(xì)胞-支架復(fù)合物的形成 將膠原蛋白支架材料裁制成10 mm×10 mm×1 mm大小，利用紫外線照射及酒精浸泡消毒，培養(yǎng)液平衡后待用。培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×105/ml，表面種植0.2 ml細(xì)胞懸液，靜置4 h后，加入含20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.4 細(xì)胞-支架復(fù)合物移植 取4～6周齡大裸鼠，氯氨酮麻醉，常規(guī)消毒鋪巾。無菌條件下在其背部中線兩側(cè)皮下，對(duì)稱鈍性分離出2個(gè)潛腔，分別植入ASCs+材料(左側(cè))和空白材料(右側(cè))。無菌絲線縫合皮膚。

1.5 組織工程新生物大體觀察和生物學(xué)檢測(cè) 移植后12周處死動(dòng)物，將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測(cè)定。組織工程新生物常規(guī)冰凍切片，倒置顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 所有裸鼠術(shù)后均活動(dòng)如常，植入處表面皮膚完整、光滑，無炎癥反應(yīng)，植入物無脫出，無免疫排斥反應(yīng)，無死亡。

2.2 組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定 于移植后12周處死動(dòng)物，取出材料進(jìn)行大體觀察。從復(fù)合細(xì)胞的支架材料側(cè)獲取了約黃豆大小(約4 mm×4 mm×2 mm)的脂肪樣新生組織，空白支架對(duì)照側(cè)未見新生組織塊。對(duì)新生物進(jìn)行了濕重測(cè)定，新生組織平均濕重0.019 g，見圖1。

圖1 新生物取材 a:實(shí)驗(yàn)側(cè)新生組織;b:對(duì)照側(cè)(空白支架)無肉眼可見新生組織塊;c:新生物大體測(cè)量及濕重測(cè)定

2.3 組織學(xué)檢測(cè) 新生組織的HE染色觀察發(fā)現(xiàn)其組織結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織相似(圖2a)且油紅0染色陽性(圖2b)，證明新生組織為脂肪組織。

3 討論

組織工程學(xué)的研究主要集中在生物可降解支架材料、種子細(xì)胞、體外培養(yǎng)條件等方面，其中理想的三維支架的構(gòu)建是組織工程化人工器官、組織研究成功的前提條件［9，10］。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程所需要考慮的關(guān)鍵問題之一，膠原蛋白是目前組織工程學(xué)研究中最常用的天然生物材料，由多種糖蛋白分子組成，占機(jī)體總蛋白的 30%(85%為I型膠原蛋白)，它具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且是細(xì)胞外間質(zhì)的重要成分［11，12］。研究表明，膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調(diào)，而且可參與組織修復(fù)，是優(yōu)良的可引導(dǎo)組織再生的生物材料［13，14］。Ⅰ型膠原作為體外細(xì)胞培養(yǎng)支架時(shí)，有促進(jìn)細(xì)胞粘附和誘導(dǎo)生長(zhǎng)分化的作用，是良好的培養(yǎng)粘附劑［15，16］。故本實(shí)驗(yàn)選擇膠原蛋白支架作為研究對(duì)象。

圖2 新生物組織學(xué)檢測(cè)a:HE染色見正常脂肪組織樣結(jié)構(gòu)(×10);b:油紅0染色陽性，證實(shí)其含脂質(zhì)成分

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，將成脂誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞與Ⅰ型膠原支架復(fù)合體外混合培養(yǎng)，植入裸鼠皮下培植12周后，形成了黃豆大小的脂肪樣組織，經(jīng)組織切片、油紅0染色等觀察證實(shí)為具有成熟結(jié)構(gòu)脂肪功能的脂肪組織，而對(duì)照側(cè)(空白支架)未形成脂肪組織。研究顯示，ASCs作為種子細(xì)胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究，并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能完整的脂肪組織［17］。另外，I型膠原支架是優(yōu)良的組織工程生物載體，其良好的生物相容性，對(duì)修復(fù)大范圍的軟組織缺損尤為理想［18，19］。

雖然本研究為今后的脂肪組織工程研究提供了一種可行的方案，但關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)，生物力學(xué)，細(xì)胞分化，新生血管，計(jì)算機(jī)模擬，支架生化特性等諸多方面仍需要大量細(xì)致的研究，才有可能將這項(xiàng)技術(shù)最終應(yīng)用于臨床患者。

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