謝 煜 萍，王 晗，孫 仲 琰，葉 淑 紅，李 倩，王 際 輝

(大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

多年以來，人們致力于尋找高效低毒的抗癌藥物，天然產(chǎn)物共軛亞麻酸由于其多種保健功效成為熱點之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其能抑制腫瘤細胞生長，可能的機制包括誘導細胞凋亡，改變信號轉導等途徑。

β－桐酸(t9，t11，t13－CLnA)是共軛亞麻酸的一種常見異構體，主要存在于桐油及苦瓜籽油中。近年來報道稱共軛亞麻酸具有抑制腫瘤形成、提高免疫力、影響脂類代謝和減肥等多種保健功效[1－3]，且研究證明全反式的共軛雙鍵結構如β－桐酸、β－金盞花酸較非全反式的α－桐酸、α－金盞花酸具有更強的抗癌及促凋亡功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，β－桐酸對膀胱癌T24細胞的生長有明顯抑制作用，但是其具體作用機理尚且不清楚。因此本實驗在細胞水平上研究了β－桐酸對膀胱癌T24細胞的凋亡率的影響，以及與凋亡相關蛋白的變化情況，從而探索其凋亡誘導機制。對開發(fā)我國天然共軛亞麻酸資源，提高天然共軛亞麻酸資源附加值，發(fā)現(xiàn)潛在膀胱癌的藥物原料，有著重要的理論和實際意義。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

人膀胱癌T24細胞，中國科學院細胞庫；β－桐酸，瑞典 Larodan Fine Chemicals AB；RPMI－1640細胞培養(yǎng)液，美國Sigma公司；胎牛血清，美國 HyClone公 司；Hoechst 33342、Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒，杭州碧云天生物技術研究所；MTT，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

CO2恒溫培養(yǎng)箱，MCO－17A，日本三洋電機株式會社；超低溫恒溫冰箱，NU－6382，日本三洋電機株式會社；流式細胞儀，Cell Lab Quanta SC，美國貝克曼公司；倒置熒光顯微，AE30／31，廈門Motic公司；酶標儀，TECAN SUNRISE，奧地利TECAN公司。

1.3 實驗條件

1.3.1 Hoechst33342熒光染色結果

取對數(shù)生長期的膀胱癌T24細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，以含有10% 胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。加入不同濃度的β－桐酸，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去原培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入含5μg／mL的Hoechst 33342的培養(yǎng)液，于37℃下孵育10min。在熒光顯微鏡下觀察細胞被標記情況，用紫外光激發(fā)，最大激發(fā)波長為346nm，發(fā)出藍色熒光，發(fā)射波長為460nm。

1.3.2 流式細胞檢測

取對數(shù)期膀胱癌T24細胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度的β－桐酸，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用0.25%胰酶消化細胞，收集細胞，制成單細胞懸液。用PBS將懸浮細胞洗滌2次，用500μL的Annexin V Binding Buffer重懸細胞，加入5μL Annexin V－FITC混勻后，再加入5μL PI，混勻，避光室溫反應10min后，利用流式細胞儀進行檢測，定量反映細胞凋亡率。

1.3.3 Western Blot實驗

取對數(shù)期膀胱癌T24細胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取出6孔板，棄舊培養(yǎng)液，加入一定濃度的β－桐酸和T0070907，每種濃度設3個復孔，同時設立對照組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。用PBS洗滌后，在冰上向每個孔內(nèi)加入100μL細胞裂解液，然后迅速刮取蛋白，并離心煮沸分裝待用。蛋白被SDS－PAGE分離后，將凝膠上蛋白轉膜、封閉，孵育一抗，用PBST洗去非特異性結合一抗；之后孵二抗，再用PBST洗掉未結合的二抗，隨后與ECL顯色液A、B的混合液相混，經(jīng)不同曝光時間使膠片感光，最后膠片在定影顯影液中顯色用于分析。

1.3.4 細胞活力測定

本實驗采用MTT法來測定癌細胞的相對活力，將處于對數(shù)期生長的膀胱癌T24細胞接種于96孔板上，接種濃度為103個／孔，培養(yǎng)過夜，分別向每孔中加入不同濃度的β－桐酸及PPARγ抑制劑T0070907，作用24h后，除去培養(yǎng)液，向每孔加 MTT(0.5mg／mL)100μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加DMSO 150μL，振蕩，室溫放置10min。用酶標儀在570nm波長處檢測其吸光度。按公式計算細胞存活率，每組實驗至少重復3次：

1.3.5 統(tǒng)計學分析方法

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(X±S)表示，采用Origin Pro7.5進行t檢驗分析。以P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 β－桐酸對T24細胞形態(tài)的影響

熒光Hoechst 33342染料能特異性結合細胞內(nèi)DNA，如圖1A所示，正常細胞核呈彌散均勻熒光，核膜規(guī)整呈圓形，熒光較弱。由圖1B～D可以發(fā)現(xiàn)，β－桐酸作用濃度20μmol／L時，細胞體積變小，熒光加強，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；而濃度增至40μmol／L時，細胞核碎裂，染色增強，呈濃染致密的顆粒塊狀強熒光，凋亡現(xiàn)象顯著[5]。結果表明，β－桐酸可以誘導T24細胞發(fā)生凋亡。

圖1 β－桐酸處理后T24細胞形態(tài)學觀察Fig.1 Morphology observation of T24cells treated withβ－eleostearic acid

2.2 β－桐酸對T24細胞凋亡率的影響

當不同濃度的β－桐酸(10、20、40μmol／L)分別作用T24細胞24h后，應用流式細胞術檢測T24細胞凋亡率顯示，對照組凋亡率不足5%，而隨著β－桐酸濃度增加，細胞凋亡率顯著升高。當β－桐酸的濃度為20μmol／L時，細胞的凋亡率約為50%左右，與對照組相比有顯著性差異。當濃度達到40μmol／L時，T24細胞的凋亡率達到78%左右，極大地抑制了細胞活力[6]。這與MTT所得結果相吻合，β－桐酸對T24細胞的生長抑制作用可能是通過誘導其凋亡來實現(xiàn)的。

圖2 β－桐酸對細胞凋亡的影響Fig.2 Effect ofβ－eleostearic acid on T24cell apoptosis

2.3 β－桐酸對凋亡相關蛋白表達的影響

Caspase－3作為終端執(zhí)行者在各種刺激信號誘導的細胞凋亡發(fā)揮著重要作用，其表達量的上調(diào)被看做是凋亡的重要表現(xiàn)之一[7]，而Bcl－2是一種能抑制細胞凋亡原癌基因，可以通過抑制線粒體釋放細胞色素C來抑制細胞凋亡，許多腫瘤中Bcl－2表達均增高[8]。圖3為蛋白免疫印跡法檢測β－桐酸對T24中凋亡相關蛋白表達的影響。由圖3發(fā)現(xiàn)，當加入β－桐酸后，Caspase－3的表達量上調(diào)，同時Bcl－2的表達量降低，提示β－桐酸誘導了T24細胞凋亡，且可能是通過線粒體途經(jīng)來完成的。

2.4 PPARγ在β－桐酸誘導T24細胞凋亡中的作用

過氧化物酶體增殖物激活性受體(PPARs)屬于家族核酸受體[9]。它們是轉錄因子，具有調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝的基因轉錄相關的功能。圖3顯示β－桐酸處理后，PPARγ的表達呈上升趨勢。

圖3 β－桐酸對T24中凋亡相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect ofβ－ESA on Caspase－3，Bcl－2，PPARγ protein expression

MTT法檢測細胞相對活力，結果如圖4所示，與對照組相比，單獨加入TT0070907時，對細胞的活力并無影響。當加入的β－桐酸時，能顯著降低細胞活力，而當加入PPARγ抑制劑T0070907后，大幅提高了細胞存活率。這與之前的Western Blot實驗結果相結合，顯示β－桐酸可能通過激活細胞內(nèi)PPARγ導致細胞發(fā)生凋亡，從而抑制了細胞的生長作用。

圖4 β－桐酸和抑制劑T0070907對細胞相對活力的影響Fig.4 Effect ofβ－eleostearic acid and T0070907on T24cell vitality

為了進一步研究β－桐酸的凋亡誘導機制，細胞培養(yǎng)液中加入PPARγ抑制劑T0070907后測T24細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的活性，結果如圖5所示。隨著β－桐酸的加入，細胞內(nèi)PPARγ蛋白表達量升高，并且Bax／Bcl－2的比值也增大。當加入PPARγ蛋白的抑制劑T0070907后，與未加抑制劑的對照相比PPARγ被顯著抑制了活性，且Bax水平下降，而Bcl－2水平上升了，由此推斷，PPARγ可能參與β－桐酸誘導T24細胞凋亡的機制中。

圖5 β－桐酸及PPARγ抑制劑 T0070907對T24中凋亡相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect ofβ－ESA and PPARγinhibitor T0070907 on apoptotic protein expression

3 結 論

本實驗通過Hoechst33342熒光染色和流式細胞術為β－桐酸能誘導膀胱癌T24細胞凋亡提供了有力的證據(jù)，且通過蛋白免疫印跡實驗結果顯示β－桐酸處理T24細胞后，細胞內(nèi)凋亡相關蛋白 Caspase－3、Bax／Bcl－2的比值和 PPARγ均上調(diào)。加入PPARγ抑制劑T0070907后檢測細胞活力，發(fā)現(xiàn)其能拮抗β－桐酸的作用，顯示β－桐酸對T24細胞的凋亡誘導作用可能是通過PPARγ的激活介導的。

本實驗為以后其他研究者更深入地研究β－桐酸的抗癌作用機理提供了思路，也為功能性的共軛亞麻酸(CLnA)作為膳食營養(yǎng)補充劑或者潛在抗癌臨床藥物或輔助藥物提供理論依據(jù)。

[1]SUZUKI R，NOGUCHI R，OTA T，et al.Cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on mouse tumor and human monocytic leukemia cells[J].Lipids，2001，36(5)：477－482.

[2]IGARASHI M，MIYAZAWA T.Preparation and fractionation of conjugated trienes from alpha－linolenic acid and their growth－inhibitory effects on human tumor cells and fibroblasts[J].Lipids，2005，40(1)：109－113.

[3]唐傳核，徐建祥，彭志英.脂肪酸營養(yǎng)與功能的最新研究[J].中國油脂，2000，25(6)：20－23.

[4]YASUI Y，HOSOKAWA M，KOHNO H，et al.Growth inhibition and apoptosis induction by alltrans－conjugated linolenic acids on human colon cancer cells[J].Anticancer Research，2006，26(3A)：1855－1860.

[5]尹勇靈，蘇秀蘭，肖鎮(zhèn).熒光染料Hoechst33342與細胞凋亡[J].白血病與淋巴瘤，2008，17(6)：476－479.

[6]朱琳超，劉永林，周郁鴻，等.流式細胞術檢測慢性再生障礙性貧血患者T細胞活化的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2012，36(7)：767－769.

[7]DEPRATERE V，GOLSTEIN P.Dismantling in cell death：molecular mechanisms and relationship to caspase activation[J].Scandinavian Journal of Immunology，1998，47(6)：523－531.

[8]YU Xiaozhong，KUBOTA H，WANG Ruisheng，et al.Involvement of Bcl－2family genes and fas signaling system in primary and secondary male germ cell apoptosis induced by 2－bromopropane in rat[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2001，174(1)：35－48.

[9]FAJAS L，AUBOEUF D，RASPE E，et al.The organization，promoter analysis，and expression of the human PPARgamma gene[J].Journal of Biological Chemistry，1997，272(30)：18779－18789.