劉苗苗，黃巧娘，郭立忠

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

槐耳，學(xué)名槐栓菌 (Trametes robiniophila Murr)，屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非禇菌目、多孔菌科、栓菌屬，是一種珍稀的藥用真菌。多糖是真菌中極為重要的活性成分，報道證實多糖具有抗癌［1］、抗腫瘤、增強機體免疫功能等作用［2］。多糖的提取工藝已經(jīng)達到比較成熟的水平，傳統(tǒng)提取方法有微波提取法［3］、酸提法、酶提法等［4］，但都存在多糖純度低、成本高、易變質(zhì)等缺點［5］。

細胞在代謝過程中會不斷產(chǎn)生帶有1個以上不配對電子的原子、原子團或分子的自由基，自由基具有高度氧化活性;當機體內(nèi)自由基過量時，會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂、細胞解體等，嚴重損傷機體［6］。研究多糖的抗氧化性，有利于尋找到有效且無毒的自由基清除劑［7］。目前，關(guān)于槐耳多糖抗氧化能力的研究鮮有報道。

本實驗在傳統(tǒng)提取多糖的方法上適當改進，通過冷堿法、熱堿法、普通法、高溫高壓法等不同方法提取槐耳子實體中的粗多糖組分，測定其多糖含量，再以DPPH法檢測不同組分相同質(zhì)量濃度下槐耳多糖抗氧化性質(zhì)的強弱。通過比較得到1種多糖含量較高且性狀穩(wěn)定的提取方法，并實現(xiàn)對槐耳多糖抗氧化能力的初步探究。

1 材料

1.1 原料

槐耳子實體由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌省級重點實驗室提供。

1.2 試劑

DPPH(11－二苯基－2－三硝基苯肼)購于Sigma公司;重蒸餾苯酚購于上海生工生物科技有限公司;葡萄糖、尿素購于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;甲醇、正丁醇購于天津市博迪化工有限公司;三氯甲烷、氫氧化鈉、濃硫酸、無水乙醇均購于萊陽市康德化工有限公司。

Sevag試劑:氯仿與正丁醇按5∶1的體積比配制。

DPPH標準液:準確稱取DPPH粉末0.099 g，用分析純甲醇溶解并定容到250 mL棕色容量瓶中，此標準液的濃度即為 1.0 ×10－4mol·L－1。

1.3 儀器設(shè)備

6202型小型臺式高速粉碎機，欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司;GTR22－1型高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司;YHG－50×55－S型遠紅外快速恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;LRH－250A型生化培養(yǎng)箱，東省醫(yī)療器械廠;752型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司等。

2 方法

2.1 槐耳多糖的提取

預(yù)處理:將一定量的槐耳子實體置于烘箱中烘至恒重，再用粉碎機將其粉碎成粉末狀。稱取10份子實體粉末，每份25 g，置于燒杯中，以10∶10∶3的比例分別加入三氯甲烷200 mL、甲醇200 mL、蒸餾水60 mL，攪拌均勻后于25℃下放置48 h進行脫脂處理，抽濾烘干。按不同方法提取多糖。

2.1.1 冷堿法

取1份脫脂后的槐耳子實體干粉，加入50 g NaOH、25 g尿素、500 mL蒸餾水，用玻璃棒攪勻后置4℃提取48 h，后用HCl調(diào)pH至中性。4 500 r·min－1離心10 min，使上清液中徹底除去子實體碎末。將上清液濃縮至粘稠狀，緩慢加入4倍體積的無水乙醇，在4℃放置24 h后，離心棄上清，沉淀進行冷凍干燥，即得粗多糖。

2.1.2 熱堿法

除提取條件設(shè)為65℃提取1 h外，其它步驟同冷堿法，最后所得組分即為熱堿法粗多糖。

2.1.3 普通法

取1份脫脂后的槐耳子實體干粉，加入蒸餾水500 mL，于90℃煮提2 h，抽濾后向子實體殘渣中再次加入500 mL蒸餾水，90℃煮提2 h，抽濾。合并2次上清液，4 500 r·min－1離心10 min，使上清液中徹底除去子實體碎末。將上清液濃縮至粘稠狀，緩慢加入4倍體積的無水乙醇，在4℃放置24 h后，離心棄上清，沉淀進行冷凍干燥，即得普通法粗多糖。

2.1.4 高溫高壓法

取7份脫脂后的槐耳子實體干粉，其中1份除提取溫度設(shè)為121℃外，其它步驟同普通法，所得組分即為高溫高壓法粗多糖。

另外6份分別按下述方法處理。

(1)高溫高壓分級醇沉法

取2份脫脂后的槐耳子實體干粉，分別加入蒸餾水500 mL，在121℃條件下煮提2 h，抽濾后向殘渣中再次加入500 mL蒸餾水，121℃煮提 2 h，抽濾，合并 2次上清液，4 500 r·min－1離心10 min，將上清液分別濃縮至粘稠狀。取1份用Sevage法做除蛋白處理，即向槐耳多糖濃縮液中加入1/4體積的Sevag試劑，混合振蕩30 min進行分離，靜置，取水相，重復(fù)該處理2次～3次。另1份不做。向上清中緩慢加入1倍體積的乙醇 (乙醇終濃度1/2)，在4℃放置24 h后，離心得一級醇沉多糖;上清再加1倍體積的乙醇 (乙醇終濃度2/3)，在4℃放置24 h后，離心得二級醇沉多糖;上清再加1倍體積的乙醇 (乙醇終濃度3/4)，在4℃放置24 h后，離心得三級醇沉多糖;上清再加入1倍體積的乙醇 (乙醇終濃度4/5)，在4℃放置24 h后，離心得四級醇沉多糖。沉淀分別進行冷凍干燥，即得4種不脫蛋白的分級醇沉粗多糖和4種脫蛋白的分級醇沉粗多糖。

(2)脫蛋白高溫高壓分倍醇沉法

取4份脫脂后的槐耳子實體干粉，分別加入蒸餾水500 mL，在121℃條件下煮提2 h，抽濾后向殘渣中再次加入500 mL的蒸餾水，121℃煮提2 h，抽濾，合并2次上清液，4 500 r·min－1離心10 min，將上清液分別濃縮至粘稠狀。按上述方法做除蛋白處理。充分混勻后將其導(dǎo)入分液漏斗，靜止3 h，分液清晰后除去有機層和蛋白乳化層，重復(fù)2次。除蛋白后的上清液分別加入1倍、2倍、3倍、4倍體積的乙醇，在4℃放置24 h后，離心棄上清，沉淀分別進行冷凍干燥，即得4種脫蛋白的分倍醇沉粗多糖。

2.2 粗多糖含量測定

測定方法參考《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準 NY/T 1676－2008食用菌中粗多糖含量的測定》［8］。

2.3 抗氧化能力的測定

將各種方法提取出的槐耳多糖配制成濃度為0.25 g·L－1的待測樣品溶液。取2.0 mL待測樣品溶液，加入2.0 mL DPPH標準液，立即混勻，在室溫條件下靜置30 min后，以蒸餾水調(diào)零，于517 nm處測吸光度值A(chǔ)i。多糖對DPPH清除率R(%)的計算公式為:

R=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%式中:Ai為待測樣品溶液與DPPH標準液反應(yīng)后的吸光度;Aj為未加入DPPH標準液時的吸光度，即待測樣品溶液2.0 mL，甲醇溶液2.0 mL;A0為未加入待測樣品溶液時的吸光度，即DPPH標準液2.0 mL，甲醇溶液2.0 mL。

每一樣品平行測3次，取平均值，計算清除率。

3 結(jié)果和分析

3.1 多糖含量測定

以冷堿法、熱堿法、普通法和高溫高壓法為主要方法提取槐耳多糖，分別測其多糖含量，見表1。

表1 不同方法提取槐耳多糖的多糖含量

從表1得知，利用高溫高壓法提取的多糖，其多糖含量最高，為34.59%，故又對槐耳子實體進行了高溫高壓分級醇沉和脫蛋白高溫高壓分倍醇沉處理，其中高溫高壓分級醇沉法又設(shè)置了未脫蛋白組和脫蛋白組進行比較，數(shù)據(jù)見表2。

表2 高溫高壓分級醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量

表2數(shù)據(jù)顯示，在高溫高壓分級醇沉實驗中，脫蛋白組所得多糖的多糖含量明顯優(yōu)于未脫蛋白組，但2組均是經(jīng)過二級醇沉后多糖含量最高，分別為29.24%和41.32%。脫蛋白高溫高壓分倍醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量見表3。

表3 脫蛋白高溫高壓分倍醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量

由表3可知，在脫蛋白高溫高壓分倍醇沉實驗中，經(jīng)過3倍醇沉處理后的槐耳多糖，其多糖含量最高，為33.52%。

綜合以上數(shù)據(jù)，經(jīng)過脫蛋白處理的高溫高壓二級醇沉法所得多糖的多糖含量最高，為41.32%。

3.2 DPPH法測定抗氧化能力

不同方法提取槐耳多糖的抗氧化性情況見圖1。

由圖1可知，冷堿法、普通法和高溫高壓法所提多糖對DPPH的清除能力相差不大，而熱堿法所提多糖對DPPH的清除率達到45.71%，明顯優(yōu)于其它3種方法。高溫高壓分級醇沉法提取槐耳多糖的抗氧化性情況見圖2。

圖2顯示，隨著醇沉級數(shù)的增加，未脫蛋白組和脫蛋白組多糖對DPPH的清除能力均呈逐漸下降趨勢。通過比較可知，脫蛋白組中經(jīng)過一級醇沉處理所得多糖的抗氧化性最強。脫蛋白高溫高壓分倍醇沉法提取槐耳多糖的抗氧化性情況見圖3。

由圖3可知，隨著醇沉倍數(shù)的增加，多糖的清除能力呈逐漸下降趨勢，一級多糖清除率最高，為53.37%。

綜合以上數(shù)據(jù)，經(jīng)過脫蛋白處理的高溫高壓一級醇沉法所得多糖，其抗氧化能力最強，為54.73%。

4 討論

本實驗通過7種不同方法提取槐耳中的粗多糖成分，分別對其多糖含量和抗氧化能力進行測定。數(shù)據(jù)表明，多糖含量的高低與抗氧化能力的強弱并不呈正相關(guān)。本研究中，多糖含量最高、抗氧化性最強的槐耳多糖分別是經(jīng)過脫蛋白處理的高溫高壓二級和一級醇沉多糖，含量分別為41.32%和54.73%。

槐耳野生資源稀缺，人工培育困難。本實驗的進行，無論是在多糖含量上還是抗氧化性方面，都證明脫蛋白高溫高壓分級醇沉法優(yōu)于其它方法，這為實現(xiàn)槐耳多糖的高效利用提供了一種可借鑒的提取技術(shù)，且初步證明槐耳多糖具有較好的自由基清除能力，是一種有效的天然抗氧化物質(zhì)，為全面開發(fā)槐耳在醫(yī)藥、保健品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

在高溫高壓法延伸實驗中，經(jīng)過脫蛋白處理的一級和1倍醇沉多糖，它們的多糖含量理論上應(yīng)該是一致的，但實際檢測結(jié)果為31.18%和23.02%，這表明本實驗脫蛋白處理的效果還不夠理想，尤其在分倍醇沉多糖時，其中的蛋白質(zhì)清除不夠徹底。脫蛋白組一級多糖對DPPH的清除率高于未脫蛋白組的一級多糖，四級多糖則明顯小于未脫蛋白組。分析原因，在槐耳中抗氧化作用最為有效的成分可能是多糖蛋白復(fù)合體，一級多糖中可能帶有更多的蛋白，使其對DPPH的清除能力增強，而四級多糖蛋白去除率高，導(dǎo)致其抗氧化性減弱。同時Sevag試劑脫蛋白也有其不足之處，如處理次數(shù)不夠、工藝流程長、水相和有機相較難分離等因素均會影響實驗結(jié)果，且本實驗只采用DPPH法檢測槐耳多糖的抗氧化能力，鄰苯三酚自氧化法、Feton法、應(yīng)用色譜法等其它測定方法對槐耳多糖不同分子量段抗氧化性強弱的檢測有待進一步研究。

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［8］NY/T 1676－2008，食用菌中粗多糖含量的測定 ［S］．中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，2008．