羅 蘭 侯 杰 邱 冰 曹惠君 魏鳳香
(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科,黑龍江 佳木斯 154002)
冬凌草甲素(ORI)是從唇形科香茶菜屬〔Rabdosia(Bl.)Hassk.〕植物中分得的一種貝殼杉烯二萜類化合物。冬凌草中主要抗癌活性成分是 ORI,其味道極苦〔1,2〕,具有清熱解毒、消炎止痛、抗腫瘤之功效,用于治療扁桃體炎、咽喉腫痛,對多種癌癥有緩解癥狀和延長生存時間的作用,也可作為增強放化療療效的輔藥〔3〕。研究表明,ORI對20余種人癌細胞株生長均有明顯的直接抑制作用〔4〕。前期工作表明 ORI對人胰腺癌SW1900細胞具有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用,同時抗凋亡蛋白Bcl2-2表達的降低和促凋亡蛋白Bax上調(diào)是ORI體外誘導(dǎo)胰腺癌SW1900細胞發(fā)生凋亡的重要作用機制之一〔5〕。磷酸化的組蛋白(H2AX)可以作為DNA損傷早期檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。本課題組觀察不同濃度的ORI注射劑誘導(dǎo)胰腺癌SW1900細胞的DNA損傷作用,并探討H2AX蛋白的表達情況。
1.1 材料 ORI由中國科學(xué)院昆明植物研究所提供,用DMSO溶解(濃度≤0.1%)DMEM培養(yǎng)基;小牛血清(美國Gibco公司);H2AX(1∶100),γ-H2AX(1∶100),Phos-S1981ATM γ-H2AX(1∶100,Cell Signalling,辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000,Santa Cruz Biltechnology公司);β-actin(美國Santa Cruz公司)。低熔點瓊脂糖(德國Merck-Darmstadt公司)。EB(PI,美國 Sigma公司)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌SW1990細胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
1.2.2 彗星試驗 參照Hockemeyer等〔6〕的方法改良。不同濃度的 ORI(20,40,80 μmol/L)處理 SW1900 細胞 48 h 后,收集2×106/ml細胞,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。制備0.5%的正常熔點瓊脂糖和0.5%的低熔點瓊脂糖。取細胞懸液與0.5%低熔點瓊脂糖混勻后加到預(yù)處理過的磨砂玻片上經(jīng)細胞裂解和DNA解旋后于4℃、25 V、300 mA條件下電泳25 min;經(jīng)過中和、蘇木素-伊紅(EB)染色、低溫避光,最后在熒光顯微鏡下計數(shù)拖尾細胞百分數(shù)(彗星率)并測量拖尾細胞尾長。每個樣本隨機測量100個彗星細胞的尾長和300個細胞中彗星樣細胞的數(shù)目。
1.2.3 Western印跡檢測H2AX蛋白表達 不同濃度的ORI(20,40,80,160 μmol/L)處理 SW1900 細胞 48 h 后,收集 2 ×106/ml細胞,用預(yù)冷的PBS洗2次,在4℃裂解30 min,離心15 min,考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。然后進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離,再進行免疫印跡,將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,浸沒于封閉液(含1%BSA的TBS)中搖蕩1 h.封閉后,進行一抗孵育,將一抗按照推薦濃度溶于封閉液中,與對應(yīng)膜共同封閉在塑料袋中,4℃下過夜。一抗孵育結(jié)束后,用TBST(TBS+0.1%Tween20)漂洗膜4次,每次15 min,再使用對應(yīng)的二抗孵育,按照相應(yīng)比例稀釋(1∶1 000~1∶10 000),室溫輕搖 1 h,二抗孵育結(jié)束后,再用TBST漂洗膜4次,每次15 min,最后使用辣根過氧化物酶發(fā)光顯色法(HRP-ECL)對膜進行顯色曝光。
1.2.4 免疫熒光檢測γ-H2AX焦點 調(diào)整細胞濃度至1×105/ml,按每孔2 ml的體積,接種細胞于6孔板中,設(shè)對照組和不同濃度的 ORI(20,40,80 μmol/L)處理 SW1900 細胞 48 h后,處理結(jié)束,4%多聚甲醛冰上固定,一抗室溫孵育2 h,加入熒光二抗37℃孵育1 h,4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室溫孵育15 min。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察計數(shù)、采集圖像,每組實驗重復(fù)3次,每張玻片至少計數(shù)50個細胞。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析及直線相關(guān)回歸分析。
2.1 彗星實驗結(jié)果 見表1。與空白對照組相比,不同濃度ORI處理的細胞彗尾長度及彗星率增加(P<0.01),并隨著質(zhì)量濃度的增加,細胞彗尾長度及彗星率增加,呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)。
表1 各組彗尾長度與彗星率比較(±s,n=9)
表1 各組彗尾長度與彗星率比較(±s,n=9)
與空白對照組比較:1)P<0.05
組別 彗尾長度 彗星率(%)空白對照組5.55±0.8 7.03±1.1 ORI組 20 μmol/L 19.96 ±4.81) 25.49 ±1.61)40 μmol/L 33.14 ±4.91) 51.12 ±1.11)80 μmol/L 43.12 ±4.651) 95.49 ±4.91)
2.2 ORI對SW1900細胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點形成的影響 對照組幾乎沒有Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點形成,各實驗組Phos-S1981ATM和γ-H2AX的焦點數(shù)明顯增加。隨ORI濃度的增加,SW1900細胞平均焦點數(shù)和焦點細胞率呈逐漸增加趨勢(P<0.05)。見圖1。
2.3 Western印跡結(jié)果 不同濃度的 ORI(DMSO,20,40,80 μmol/L)處理SW1900細胞48 h后結(jié)果表明,隨著濃度的增加,γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(P<0.05)。見圖2。
圖2 冬凌草甲素對SW1900細胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點的影響(×1 000)
圖2 Western印跡結(jié)果
H2AX是一類進化上保守的組蛋白H2A的變體〔7〕。DSB的早期生物效應(yīng)標(biāo)志之一,就是組蛋白H2AX的快速和大量磷酸化,即形成γ-H2AX,γ-H2AX招募修復(fù)蛋白并在DSB周圍形成焦點,一個γ-H2AX焦點就代表著一處DSB,γ-H2AX的焦點數(shù)越多,表明細胞內(nèi)的DSB越多,γ-H2AX已成為檢測DSB的“金標(biāo)準(zhǔn)”〔8,9〕。因此,本研究選擇 γ-H2AX作為檢測指標(biāo),分析了ORI對體外胰腺癌細胞DNA的損傷。
與其他一些常見的惡性腫瘤相比,胰腺癌的治療效果較差。外科手術(shù)仍然是最有可能為胰腺癌帶來治愈希望的治療手段,但是綜合治療必不可少。本研究免疫熒光和Western印跡結(jié)果表明,ORI作用濃度越高,細胞發(fā)生DSB的部位越多,這與ORI的抗腫瘤機制相佐證。彗星實驗結(jié)果還顯示,當(dāng)ORI作用濃度增加,DNA損傷程度也增加,免疫熒光結(jié)果與彗星實驗結(jié)果相一致。DNA損傷反應(yīng)是細胞應(yīng)對基因毒壓力所產(chǎn)生的反應(yīng),包括DNA修復(fù)、細胞周期阻滯、細胞凋亡等,真核生物細胞的遺傳物質(zhì)能夠正確復(fù)制并被精確傳到下一代,主要是由于細胞擁有一套有效的DNA損傷反應(yīng)機制。共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因(ATM)和Rad-3相關(guān)蛋白(ATR)激酶可以感知DNA損傷,并將DNA損傷信號傳導(dǎo)到下游靶蛋白,啟動應(yīng)激系統(tǒng),產(chǎn)生細胞周期阻滯,從而完成DNA修復(fù)或啟動細胞凋亡程序〔10~12〕,因此ATM和ATR對維持細胞基因組的穩(wěn)定和防止腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要。
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