張讀樸，彭飛，烏斯?jié)M江，黃炯,2，張玉紅，劉淑梅，趙海源，王洪巧

（新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032；2 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆烏魯木齊 830000）

不同保存溫度對(duì)布氏菌病活疫苗(S2株）細(xì)菌存活的影響

張讀樸1，彭飛1，烏斯?jié)M江1，黃炯1,2，張玉紅1，劉淑梅1，趙海源1，王洪巧1

（新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032；2 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆烏魯木齊 830000）

《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定布氏菌病活疫苗貯藏條件為2℃～8℃，有效期為一年。但在疫苗檢驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)保存在2℃～8℃條件下的布氏菌病活疫苗活菌數(shù)下降的幅度較大，造成活菌數(shù)時(shí)有不達(dá)標(biāo)的情況。為了保證疫苗在一年有效期內(nèi)的活菌數(shù)量，常常采用增大附加量（計(jì)算頭份時(shí)一般不少于30%的附加量）或低溫冷凍條件保存（-15℃以下）的方法?？紤]到疫苗的安全性和成本，增大附加量并不是可采用的好方法，低溫存放卻易于做到。為了驗(yàn)證2℃～8℃保存和-15℃以下低溫冷凍保存的效果，本研究對(duì)比了3批布氏菌病活疫苗（S2株）在不同溫度條件保存對(duì)細(xì)菌存活的影響。

一、材料與方法

1.疫苗。本公司生產(chǎn)的布氏菌病活疫苗（S2株），批號(hào)分別為2010004批、2012006批和2012007批。

2.培養(yǎng)基。胰蛋白眎瓊脂平板、蛋白胨水。

3.試驗(yàn)方法。以保存1月為周期，每批取2℃～8℃和-15℃保存的疫苗各3瓶，每瓶加適量蛋白胨水充分溶解均勻，然后用蛋白胨水10倍系列稀釋至10-9，取0.1ml滴胰蛋白眎瓊脂平板3個(gè)，37℃培養(yǎng)72～96 h數(shù)平板上的菌落數(shù)，3個(gè)平板上菌落數(shù)相加除以3乘以疫苗瓶加量（ml）即為每瓶活菌數(shù)（CFU）。3瓶活菌數(shù)（CFU）平均即為當(dāng)月保存后的細(xì)菌活菌數(shù)（CFU）。疫苗剛生產(chǎn)出活菌計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)（CFU）即0個(gè)月為計(jì)算活菌率的基數(shù)，計(jì)算細(xì)菌存活率。

4.統(tǒng)計(jì)分析。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5.0，對(duì)同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率進(jìn)行配對(duì)數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，對(duì)同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率進(jìn)行單因素方差分析和Tukey's 多重比較。

二、結(jié)果

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過對(duì)3批布氏菌病活疫苗（S2株）分別保存在2℃～8℃和-15℃的疫苗1年12次的活菌計(jì)數(shù)檢測(cè)，顯示在2℃～8℃條件下保存的疫苗，3批疫苗從第3個(gè)月起，活細(xì)菌數(shù)均明顯下降，存活率在57.9～69.6%之間；至第12個(gè)月時(shí)存活率已經(jīng)降至約36.37～48.18%之間。在-15℃以下條件保存的疫苗，在12個(gè)月的檢測(cè)過程中，只有2010004批細(xì)菌存活率最低，為60.29%，2012006批在80%以上，2012007批在75%以上。各批細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表略，存活率變化情況見圖1。

2.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5.0，對(duì)同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率，以及對(duì)同一保存溫度不同批次疫苗的菌存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

三、討論

由計(jì)數(shù)結(jié)果和折線圖可見，2℃～8℃和-15℃保存的3批布氏菌病活疫苗（S2株），活菌率后者均明顯優(yōu)于前者。2010004批疫苗保存1年后菌存率2～8℃為36.27%，-15℃為60.29%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P ＜0.01），且后者比前者高24.02%；2012006批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃為44.63%，-15℃為84.36%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P＜0.01），且后者比前者高39.73%；2012007批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃為48.18%，-15℃為89.63%，2℃～8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P＜0.01），且后者比前者高41.45%。通過對(duì)比分析顯示，三批布氏菌病活疫苗（S2株）的活菌率2℃～8℃保存的與-15℃保存的活菌率差異性極顯著（P ＜0.01）。

2012006、2012007兩 批疫苗在1年的菌存率檢測(cè)中均比2010004批疫苗高，其中，2010004批疫苗2℃～8℃保存的菌存率與2012006批疫苗差異性顯著（P＜ 0.05），與 2012007批疫苗差異性極顯著（P＜0.01）；2010004批疫苗-15℃保存的菌存率與2012006、2012007批疫苗均差異性極顯著（P＜0.01）。出現(xiàn)這種情況，可能是制造疫苗的批間差異，前兩批疫苗的菌液收獲時(shí)機(jī)比較合適，細(xì)菌處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定前期階段，細(xì)菌比較健壯（幼齡和老齡都極易死亡）。掌握好菌液收獲時(shí)間很重要，既要收獲的細(xì)菌活力好，又要活菌數(shù)高。在生物制品生產(chǎn)過程中，一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲菌液。細(xì)菌的形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到靜止期中期的細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。

有文章報(bào)道，布魯氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率為78.5～82.3%。 布魯氏菌病活疫苗（S19株）保存一年活菌率為82.54～82.64%。本次試驗(yàn)證實(shí)布氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率僅為36.27%～48.18%，遠(yuǎn)低于報(bào)道的78.5～82.3%的水平。

以往通氣生產(chǎn)布氏菌病活疫苗的收獲菌液活菌數(shù)只有幾百億CFU/ml，個(gè)別的能達(dá)到1000億CFU以上/ml，牛種更低一些。隨著技術(shù)的進(jìn)步，設(shè)備裝備水平的提高，培養(yǎng)基質(zhì)量的改進(jìn)，生產(chǎn)人員經(jīng)驗(yàn)的積累，反應(yīng)罐布氏菌病活疫苗（S2株）菌液通氣生產(chǎn)細(xì)菌增殖水平顯著提高，據(jù)筆者粗略統(tǒng)計(jì)，本公司2010年度生產(chǎn)的37批布氏菌病活疫苗（S2株）菌液活菌數(shù)平均為717億CFU/ml；2011年度49批活菌數(shù)平均為1328億CFU/ml；2012年度9批活菌數(shù)平均為1164億CFU/ml。細(xì)菌生長(zhǎng)的好，繁殖的快有時(shí)也會(huì)死亡的快，筆者在做牛出敗疫苗檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基中添加血清時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)的好，活菌數(shù)也很高，但存放一定時(shí)間后細(xì)菌死亡的很快。布氏菌病活疫苗（S2株）是否也有這方面的原因，還需證實(shí)。

圖1 三批布氏菌病活疫苗（S2株）不同保存溫度菌存率

表2 同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比較分析

表3 同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比較分析

影響疫苗質(zhì)量的因素很多，如細(xì)菌種子的質(zhì)量、培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)溫度、菌液培養(yǎng)時(shí)加糖量的多少、通氣量的大小、培養(yǎng)過程PH值的變化、菌液收獲時(shí)間、菌液存放時(shí)間、保護(hù)劑質(zhì)量、凍干曲線等，哪個(gè)環(huán)節(jié)有問題都會(huì)對(duì)產(chǎn)品造成影響。各個(gè)工序都應(yīng)該認(rèn)真研究總結(jié)，探索最佳條件，以期生產(chǎn)出質(zhì)量過硬的產(chǎn)品。

根據(jù)細(xì)菌存活的生物學(xué)特性，低溫可以延緩微生物死亡，例如牛瘟兔化弱毒疫苗的新鮮淋脾毒在0℃～4℃只能保存14 d，而在-10℃～-15℃就可保存3個(gè)月；豬瘟兔化弱毒疫苗的新鮮脾淋在0℃～4℃只能保存14 d，而在-15℃則可保存6個(gè)月。本次研究結(jié)果也證實(shí)：-15℃保存明顯優(yōu)于2℃～8℃保存，-15℃保存對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量起著非常重要的作用，建議修改布氏菌病活疫苗貯藏的規(guī)定，將2℃～8℃貯藏調(diào)整為-15℃以下貯藏。

（略）