王文秀，馬 超，杜文才

(天津市西青醫(yī)院呼吸科，天津 300380)

TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表達及意義

王文秀，馬 超，杜文才

(天津市西青醫(yī)院呼吸科，天津 300380)

目的 觀察TNF-α在COPD患者血清中的表達水平，并探討其與COPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 實時熒光相對定量PCR(RQ-PCR)方法檢測40例COPD患者組及40例正常對照組血清中TNF-α mRNA表達水平，通過SPSS15.0軟件進行配對t檢驗。結(jié)果 采用2-ΔΔCt方法計算出正常組TNF-α mRNA表達比值為2.39，COPD組TNF-α mRNA表達比值為4.01。COPD病變組中TNF-α mRNA的表達量顯著高于正常對照組，P＜0.05。結(jié)論 TNF-α參與COPD的病理過程。

TNF-α;COPD;炎癥;細胞因子;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，是一種長期、慢性、反復(fù)發(fā)作且逐漸加重的疾病，給社會和患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔。隨著對COPD研究的深入，其發(fā)病機制復(fù)雜，主要病理特征為氣道慢性炎癥［1-2］。氣道慢性炎癥的發(fā)病機制是IL-8、GM-CSF及ICAM-1等蛋白因子介導中性粒細胞在肺氣道組織粘附、跨血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)移、趨化等過程最終引起慢性炎癥［3-4］。研究證實TNF-α能誘導成纖維細胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E2(PGE2)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF);刺激巨噬細胞產(chǎn)生 IL -1β、IL -17［5-6］;并且增強細胞內(nèi)ICAM-1的表達［7］。本研究主要采用實時熒光相對定量 PCR(RQ-PCR)，從基因水平觀察TNF-α在COPD中的表達情況，并探討其在COPD發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料和方法

1.1 標本來源

根據(jù)2007年中華醫(yī)學會制定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)診治規(guī)范診斷標準［8］，收集2011年6月—12月在天津市西青醫(yī)院門診就診和住院治療的COPD患者40例，30例男性和10例女性患者，年齡51～77歲，平均年齡(61±10)歲，平均病程(8±7)年。另外選擇40例來自天津市西青醫(yī)院的健康體檢者作為正常對照組，其中男19例，女21例，平均年齡(59±10)歲。排除標準:合并有嚴重心、腦、肝、腎疾病或合并腫瘤者，患有免疫系統(tǒng)疾病者，近期使用過激素等影響免疫系統(tǒng)藥物者。

所有研究對象均于晨起空腹采集肘靜脈血4 mL，將血注入加有100 g/L的依地酸二鈉鈣(EDTA)50 μL和抑肽酶800 U的試管中混勻抗凝離心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存待檢。

1.2 實時熒光相對定量PCR(RQ-PCR)

1.2.1 總RNA的抽提:取血清標本約1 mL，加入1 mL TRIzol(美國Invitrogen公司)吹打勻漿，按照試劑盒說明書操作，收集組織總 RNA溶于20 μL DEPC處理水，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA的合成和熒光定量PCR檢測TNF-α mRNA的表達:采用ReverTra Ace Qpcr RT kit試劑盒(日本 TOYOBO公司)，按照試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所得cDNA保存于-20℃ 冰箱備用。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物做模板，用特異性引物進行PCR反應(yīng)。所有引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。引物序列見表1。

表1 引物表Tab 1 Primer table

使用 SYBR Green Real-timePCR MAster MiX試劑盒(TOYOBO公司)，按照試劑盒說明書配成50 μL反應(yīng)體系，每個樣本做個復(fù)孔，同時設(shè)不加模板cDNA的陰性對照。在 ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)上進行基因擴增:50℃2 min，95℃10 min，循環(huán)40次。結(jié)果采用2-ΔΔCt的方法分析 TNF-α mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。每個標本平行重復(fù)檢測PCR 3次取均值，采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA的純度和濃度鑒定

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測抽提RNA的純度和濃度，電泳顯示RNA標本28S、18S和5S 3條帶清晰，28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍，說明抽提的 RNA純度較好;選取260 nm和280 nm吸光度值(A)比值(A260/A280)為1.8～2.2的標本為合格標本進行下一步實驗。

2.2 TNF-α RQ-PCR擴增產(chǎn)物電泳

收集PCR擴增產(chǎn)物，取10 μL在1.5%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液中電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示。電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物呈單一亮帶，片段大小為307 bp，擴增特異性良好。

2.3 TNF-α mRNA在COPD病變組和正常對照組中的表達水平

圖1 TNF-α RQ-PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig 1 TNF- α RQ-PCR amplification product electrophoresis

所有標本均重復(fù)檢測3次取均值，反應(yīng)完成后讀取閾值(Ct)。采用 2-ΔΔCt方法計算出正常組TNF-α mRNA表達比值為2.39，COPD組 TNF-α mRNA表達比值為4.01。結(jié)果顯示COPD病變組中TNF-αmRNA的表達量均顯著高于正常對照組(P ＜0.05)。

3 討 論

COPD是一種以進行性氣流受限為特征的慢性肺通氣功能障礙性疾病，其致病原因和發(fā)病機制非常復(fù)雜，可以逐漸形成肺動脈高壓，并最終導致肺源性心臟?。?-10］。研究證實COPD的主要病理特征是氣道、肺實質(zhì)以及肺血管的慢性炎癥［11］。其氣道慢性炎癥是通過肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等免疫細胞產(chǎn)生的多種細胞因子介導的結(jié)果［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素 -8、白細胞介素 -6、TNF-α以及IFN-γ在內(nèi)的細胞因子是構(gòu)成COPD氣道慢性炎癥的復(fù)雜的炎癥細胞網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，它們之間互相促進，促使局部炎癥發(fā)生、發(fā)展，最終導致氣道的重塑和氣道的阻塞［14］。作為重要的促炎癥因子，TNF-α在自身免疫和慢性炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用［15］。TNF-α可以增加成纖維母細胞黏附分子(ICAM-1)的表達;刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞或成纖維細胞產(chǎn)生 IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和PGE2;誘導單核細胞趨化因子-1(MCP-1)的產(chǎn)生，從而促進中性粒細胞和單核細胞的募集和活化，促進炎癥反應(yīng)［16-17］。

本實驗采用實時熒光相對定量PCR技術(shù)，檢測了40個COPD患者血清中TNF-α的含量，從基因水平探討了TNF-α在COPD中的表達變化。實驗結(jié)果表明COPD病變組TNF-α mRNA的相對表達量顯著高于對照組，說明 TNF-α的表達與COPD相關(guān)，TNF-α可能參與COPD病變的病理過程。

本研究結(jié)果顯示COPD患者體內(nèi)TNF-α的表達及其介導的炎癥反應(yīng)與COPD病變的發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性。但是TNF-α在COPD慢性炎癥過程中究竟起到什么作用仍需要進一步研究探索。

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Expression of TNF-α in patients with chronic obstructive pulmonary disease

WANG Wen-xiu，MA Chao，DU Wen-cai
(Department of Respiration，Tianjin Xiqing Hospital，Tianjin300380，China)

［Abstract］ObjectiveTo study the expression of TNF - αin patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)，and the relationship between TNF-αexpression and COPD.MethodsThe TNF-α mRNA levels in serums of COPD patients(40 cases)and control group(40 cases)were analyzed by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RQ - PCR).ResultsThe expression ratio of control group was 2.39 and COPD group was 4.01.The data were analyzed by t testP＜0.05.ConclusionThe study suggests that involvement of TNF-α in the pathomechanism of COPD.

［Key words］TNF - α;COPD;inflammation;cytokines;reverse transcriptase polymerase chain reaction

R563.1

A

1671-7295(2013)02-0143-03

王文秀，馬超，杜文才.TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表達及意義［J］.大連醫(yī)科大學學報，2013，35(2):143-145.

10.11724/jdmu.2013.02.11

王文秀(1982-)，女，山東東營人，住院醫(yī)師，碩士。E-mail:wwx_2001@163.com

杜文才，教授。E-mail:duwencai@126.com

2012-12-20;

2013-03-06)