呂志誠，蘇芝蘭，楊文元，張鋒軍

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 干四科，甘肅蘭州 730050;2.甘肅武威市醫(yī)院 消化科，甘肅武威 733000)

靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體3小干擾RNA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

呂志誠1，蘇芝蘭2，楊文元1，張鋒軍1

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 干四科，甘肅蘭州 730050;2.甘肅武威市醫(yī)院 消化科，甘肅武威 733000)

目的 構(gòu)建靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體3(VEGFR-3)的小干擾RNA重組腺病毒表達(dá)載體。方法 將構(gòu)建的靶向VEGFR-3特異性小干擾RNA真核表達(dá)載體pGenesil-siRNA的啟動(dòng)子及siRNA序列克隆入穿梭質(zhì)粒pAdTrack，將質(zhì)粒線性化處理后轉(zhuǎn)化入pAdEasy。重組腺病毒載體線性化處理后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝重組腺病毒，并進(jìn)行PCR鑒定、病毒滴度測(cè)定;擴(kuò)增后感染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞并進(jìn)行Western blotting檢測(cè)VEGFR-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 雙酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA質(zhì)粒構(gòu)建正確，擴(kuò)增純化測(cè)定重組病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度為5.6×109pfu/mL。病毒感染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞后測(cè)定VEGFR-3蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論 靶向VEGFR-3小干擾RNA的腺病毒載體構(gòu)建成功。

VEGFR-3基因;RNA干擾;腺病毒;表達(dá)載體

淋巴轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要的轉(zhuǎn)移途徑之一，也是惡性腫瘤評(píng)價(jià)預(yù)后的一個(gè)很重要的獨(dú)立因素;與血管轉(zhuǎn)移的研究相比，淋巴轉(zhuǎn)移的研究相對(duì)滯后。淋巴管生成及其調(diào)控機(jī)制以及淋巴管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用已成為惡性腫瘤研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)重要課題。許多研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族參與了腫瘤的生長和淋巴管的生成，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［1-3］。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3)是內(nèi)皮特異性的受體酪氨酸激酶，其配體VEGF-C、D和它結(jié)合后促進(jìn)淋巴管的增生。在許多惡性腫瘤組織中，VEGFR-3均有高表達(dá)。阻斷VEGFR-3的信號(hào)通路則可能成為一種新型的廣譜性治療腫瘤的手段。本研究通過構(gòu)建VEGFR-3小干擾RNA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，為下一步阻斷VEGFR-3在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移和生長中作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

靶向VEGFR-3的pGenesil-siRNA由晶賽公司合成，pAdTrack、pAdEasy-1 質(zhì)粒、DH5α、BJ5183菌種、HEK293細(xì)胞由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，PCR試劑盒、T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶SalI、HindⅢ、EcoRI購自日本 Takara公司，PacI購自美國NEB公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒與膠回收試劑盒購于Omega公司;脂質(zhì)體2000購于Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 腺病毒穿梭載體pAdTrack-pG-siRNA的構(gòu)建:將 pGenesil-siRNA和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack用HindⅢ和SalI雙酶切，回收片段在4℃條件下T4DNA連接酶連接過夜，陽性克隆HindⅢ和SalI雙酶切鑒定，EcoRI單酶切鑒定，進(jìn)一步經(jīng)DNA雙向測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建無誤，命名為pAdTrackpG-siRNA質(zhì)粒。

1.2.2 重組腺病毒表達(dá)載體pAdEasy-pG-siRNA的構(gòu)建:pAdTrack-pG-siRNA用PmeI酶切線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌BJ5183，在濃度為50 mg/L卡那霉素抗性LB平板上篩選，37℃培養(yǎng)18～20 h后，挑選陽性克隆4個(gè)，擴(kuò)增后抽提DAN，用PmeI酶切處理鑒定正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR及PacI酶切鑒定。獲得的重組腺病毒載體命名為pAd-VEGFR3-siRNA。大量抽提重組腺病毒載體質(zhì)粒pAd-VEGFR3-siRNA備用。

1.2.3 重組腺病毒 pAd-VEGFR3-siRNA的包裝、擴(kuò)增:用PacI充分線性化pAd-VEGFR3-siRNA后，按照Lipofectamine 2000操作說明將線性化的PAd-VEGFR3-siRNA加入脂質(zhì)體稀釋液中輕輕混合，室溫下靜置20 min使其充分結(jié)合形成復(fù)合物。將混合物加入已達(dá)70%～80%貼壁融合的HEK293細(xì)胞中，輕輕混合。定期用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。7天后80%左右細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。收集細(xì)胞后分別于-80℃，37℃中反復(fù)凍融3次裂解后離心，收集病毒上清，繼續(xù)感染HEK293是細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，重復(fù)擴(kuò)增3輪。第一批上清液進(jìn)行PCR鑒定，重組的病毒顆粒反復(fù)感染HEK293是細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增。病毒液用0.22 μm 濾膜無菌過濾后分裝于1.5 mL凍存管，-80℃保存。

1.2.4 重組腺病毒pAd-VEGFR3-siRNA RTPCR鑒定:取第一輪擴(kuò)增后收集的病毒上清5 μL，加入10 μL蛋白酶K，55℃孵育1 h，100℃沸騰5 min，離心后取1～2 μL上清進(jìn)行PCR鑒定。其引物序列為:上游引物5＇-CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT -3＇，下游引物5＇-AGTCCTTCCAC GATACCA AAGT -3＇，長度約450 bp。

1.2.5 重組腺病毒pAd-VEGFR3-siRNA的純化及病毒滴度:將HEK293細(xì)胞稀釋至105個(gè)/mL后，在96孔板上按每孔100 μL接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)12 h，將收獲的重組病毒子按1×103～1×1010進(jìn)行倍比稀釋后，每個(gè)稀釋度按每孔100 μL接種，同一濃度做3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)6 h后更換為新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。按病毒效價(jià)(pfu/mL)=(熒光數(shù)×10)/稀釋度計(jì)算病毒效價(jià)。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)導(dǎo):將復(fù)蘇后的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的LB培養(yǎng)液。待其在生長倍數(shù)期時(shí)，用胰酶消化，接種6孔板，按50 MOI的量接種病毒，留1孔不加病毒作為空白對(duì)照，培養(yǎng)箱中感染3 h;然后棄盡培養(yǎng)上清，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡下觀察感染效率，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)。將總蛋白變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳與轉(zhuǎn)膜，VEGFR-3(1∶500)、β-actin抗體(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜，TBST 洗2次 ×10 min，分別加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗2次×5 min。將濾膜放入配好的顯色液中顯色15～30 min，取出濾膜，蒸餾水沖洗，晾干，掃描。

2 結(jié) 果

2.1 腺病毒穿梭載體和骨架質(zhì)粒的鑒定

HindⅢ和SalI雙酶切重組穿梭質(zhì)粒pAdTrackpG-siRNA后，瓊脂糖電泳檢測(cè)到大小分別8300 bp大片段和409 bp的目的基因片段，表明構(gòu)建成功(圖1)。陽性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定后，結(jié)果提示該質(zhì)粒構(gòu)建成功。pAdTrack-pG-siRNA線性化并轉(zhuǎn)入感受態(tài)pAdEasy-1中，同源重組后篩選出陽性克隆，用PacI酶切，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，顯示出約30 kb的大片段和4.5 kb左右的小片段各一條(圖2)。表明pAd-VEGFR3-siRNA質(zhì)粒已重組成功。

2.2 重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增

重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡下可見少量細(xì)胞有GFP表達(dá)，GFP的表達(dá)隨著時(shí)間的延長強(qiáng)度逐漸增加而逐漸增多，取適量鑒定正確的病毒上清重復(fù)感染HEK-293細(xì)胞，擴(kuò)增后收集病毒液(圖3)。

2.3 腺病毒PCR鑒定

重組病毒可以擴(kuò)增出450 bp的片段(圖4)，而空病毒未擴(kuò)增得到相應(yīng)片段。說明含VEGFR3-siRNA基因的pAdTrack-pG-siRNA已與腺病毒核心基因組pAdEasy-1發(fā)生了重組，并且重組腺病毒包裝成功。

2.4 重組腺病毒滴度測(cè)定

pAd-VEGFR3-siRNA經(jīng)繁殖、擴(kuò)增后將細(xì)胞懸液后滴加于計(jì)數(shù)板上，用GFP陽性計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，腺病毒載體滴度為5.6×109pfu/mL。

2.5 結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中VEGFR-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)

Western blotting結(jié)果(圖5)顯示，受感染pAd-VEGFR3-siRNA結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中VEGFR-3蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯降低。

圖5 VEGFR-3的Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Results of VEGFR-3 protein expression by western blotting

3 討 論

血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelia growth factor receptor 3，VEGFR-3)是血管內(nèi)皮受體家族的重要成員之一，隸屬于膜受體介導(dǎo)的酪氨酸蛋白激酶受體家族，主要參與淋巴管血管生成［4-5］。惡性腫瘤尤其是胃腸道腫瘤，在晚期均會(huì)發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，大多數(shù)晚期惡性腫瘤均不能通過手術(shù)治愈或延長生命，藥物治療是晚期腫瘤重要的治療手段之一。因此阻斷淋巴管生成的研究就顯得極為重要。

許多文獻(xiàn)認(rèn)為，VEGF-C/-D和VEGFR-3結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)控淋巴管的生成，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，在非小細(xì)胞肺癌，大腸癌，子宮內(nèi)膜癌，卵巢癌，原發(fā)性乳腺癌，前列腺癌，胃癌中VEGFR–3表達(dá)與患者的生存時(shí)間有相關(guān)性，且認(rèn)為VEGFR-3是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素;VEGFR-3的高表達(dá)與淋巴管浸潤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良生存預(yù)后相關(guān)［6-12］。因此通過抑制腫瘤細(xì)胞的VEGFR-3基因表達(dá)來阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)，抑制腫瘤淋巴管血管生成，可能會(huì)成為治療惡性腫瘤、阻斷淋巴轉(zhuǎn)移的直接、有效的手段。

siRNA技術(shù)作為一種新型的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，是疾病基因療法的理想工具。制備siRNA的方法主要有體外化學(xué)合成和DNA載體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA兩種，由于其高穩(wěn)定性、高效性、高特異性、高穿透性，發(fā)揮RNA抑制腫瘤基因表達(dá)，因此是腫瘤的靶向治療的一個(gè)新途徑。但由于化學(xué)合成和載體表達(dá)的siRNA對(duì)靶細(xì)胞抑制是暫時(shí)或瞬間性的，而且轉(zhuǎn)染效率較低及不能持續(xù)表達(dá)，限制了其作為腫瘤治療的一種有效途徑的廣泛應(yīng)用。而腺病毒載體容易復(fù)制、能有效增值、病毒滴度高、易于濃縮及儲(chǔ)存，即可以感染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染靜止細(xì)胞，還可以進(jìn)行活體感染，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞的基因組，安全性非常高，適用于基因治療。

本研究通過構(gòu)建靶向VEGFR-3小干擾RNA真核表達(dá)載體，進(jìn)一步將小干擾RNA表達(dá)載體和缺陷型腺病毒重組，以便高效轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞，提高細(xì)胞中VEGFR-3基因沉默效率，達(dá)到阻止或減少淋巴管生成的目的。經(jīng)PCR、Western blotting、雙酶切及測(cè)序，證明成功構(gòu)建了攜帶VEGFR-3 siRNA基因片段的重組腺病毒載體，并獲得了較高的病毒滴度，可以高效感染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系。這對(duì)利用構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織，并在轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得高效表達(dá)，體內(nèi)誘導(dǎo)靶細(xì)胞VEGFR-3小干擾RNA，阻斷淋巴管生成而達(dá)到抗腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的目的奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of the recombinant adenovirus expressing the short interfering RNA targeting vascular endothelia growth factor receptor 3 gene

LV Zhi-cheng，SU Zhi-lan，YANG Wen -yuan，ZHANG Feng -jun

(1.Department of Oncology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area，Lanzhou730050，China;2.Department of Gastroenterology，Gansu Wuwei City＇s Hospital，Wuwei733000，China)

［Abstract］ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus expression vector of a short interfering RNA(siRNA)targeting Vascular endothelia growth factor receptor 3(VEGFR -3)gene.MethodsThe pGenesil-siRNA expression vector promoter and siRNA，which was constructed，were subcloned to pAdTrack shuttle plasmid.The product was linearized and recombinated with pAdEasy.After linearization by PacI，the recombinant adenovirus plasmid was transfected into 293 cells for packaging and amplification，then was further identified by PCR analysis.Western blotting was used to detect the expression of VEGFR - 3 protein in the colorectal cancer cell lines LoVo infected with the adenovirus.ResultsThe pAdTrack-pG-shRNA andpAd-VEGFR3-siRNA plasmids had been successfully constructed.The titer of the recombinant virus pAd-VEGFR3 -siRNA was 5.6×109pfu/mL after amplificated and purified.VEGFR -3 protein expression decreased significantly in the colorectal cancer LoVo cells lines after infection by the recombinant virus.ConclusionWe have successfully constructed the recombinant adenovirus pAd-VEGFR3-siRNA targeting VEGFR-3 gene.

［Key words］VEGFR -3;RNA interference;adenovirus;expression vector

R321

A

1671-7295(2013)02-0139-04

呂志誠，蘇芝蘭，楊文元，等.靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體3小干擾RNA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(2):139 -142.

10.11724/jdmu.2013.02.10

呂志誠(1969-)，男，甘肅永昌人，博士。E-mail:lyuzc@sohu.com

2012-11-04;

2013-01-20)