金河田，王曉旭，樸豐源

(1.沈陽(yáng)202醫(yī)院放射治療中心，遼寧沈陽(yáng) 110000;2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

亞慢性鉛暴露小鼠睪丸組織鉛蓄積及對(duì)精子質(zhì)量影響

金河田1，王曉旭2，樸豐源2

(1.沈陽(yáng)202醫(yī)院放射治療中心，遼寧沈陽(yáng) 110000;2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的 觀察亞慢性鉛暴露小鼠睪丸組織鉛蓄積和對(duì)小鼠精子質(zhì)量影響，并探討二者的關(guān)聯(lián)性。方法昆明種小鼠60只，按體重將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L醋酸鉛染毒組。通過(guò)自然飲用含不同濃度醋酸鉛水的方式使小鼠染鉛，連續(xù)染毒60 d后取附睪和睪丸組織。用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測(cè)小鼠睪丸組織的鉛濃度，常規(guī)方法檢測(cè)附睪精子質(zhì)量，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果 0.5 g/L、1.0 g/L 和1.5 g/L 染鉛組小鼠精子的活動(dòng)度分別為87.3%、79.2%和68.3%，顯著低于對(duì)照組(94.1%)(P＜0.05)。各鉛暴露小鼠精子畸形率分別為15.2%、32.8%和35.5%，顯著高于對(duì)照組(7.0%)(P＜0.05)。各鉛暴露小鼠睪丸組織鉛濃度分別為72.71 ng/g，118.74 ng/g和177.14 ng/g，顯著高于對(duì)照組(9.73 ng/g)(P＜0.05)，并隨染毒劑量增加而升高。而且，鉛暴露小鼠睪丸鉛濃度與精子的活動(dòng)率、密度和存活率之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 亞慢性鉛暴露可導(dǎo)致小鼠睪丸組織鉛蓄積，鉛在睪丸組織蓄積可能是亞慢性暴露小鼠精子質(zhì)量下降的重要因素。

醋酸鉛;雄性生殖毒性;鉛蓄積;精子質(zhì)量

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重。其中，有毒重金屬鉛是最常見(jiàn)的環(huán)境污染物。人群流行病學(xué)調(diào)查和試驗(yàn)研究均表明，鉛暴露對(duì)精子的發(fā)生、發(fā)育及成熟具有明顯的抑制作用，引起精子數(shù)量減少、精子活力減弱和畸形率增高［1-2］，能導(dǎo)致配偶不良妊娠過(guò)程和結(jié)局并影響子代發(fā)育。鉛的上述雄性生殖毒作用嚴(yán)重影響接觸鉛育齡人群的生育能力，尤其對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育，給他們的家庭帶來(lái)極大痛苦，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。

為了觀察亞慢性鉛暴露小鼠睪丸組織鉛蓄積和對(duì)小鼠精子質(zhì)量影響及探討二者的關(guān)聯(lián)性，本研究通過(guò)使小鼠亞慢性染醋酸鉛制作鉛中毒動(dòng)物模型，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測(cè)小鼠睪丸組織的鉛濃度，常規(guī)方法檢測(cè)附睪精子質(zhì)量，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

醋酸鉛(上?；瘜W(xué)試劑廠);高級(jí)純硝酸(HNO3);優(yōu)級(jí)純過(guò)氧化氫 (H2O2);Mili-Q超純水。HNO3、H2O2和Mili-Q超純水購(gòu)于西格瑪化學(xué)公司(西格瑪，美國(guó))。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent 7500ce，安捷倫科技有限公司，美國(guó)加利福尼亞州)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

成熟健康昆明種雄性小鼠60只，體重為(20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(遼)2008-0002。小鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組15只。即對(duì)照組、0.5 g/L醋酸鉛染毒組、1.0 g/L醋酸鉛染毒組和1.5 g/L醋酸鉛染毒組。通過(guò)飲用含不同濃度醋酸鉛水的方式使小鼠染鉛。飼養(yǎng)小鼠的室內(nèi)條件如室溫(22±2)°C、濕度(60±5)%等被嚴(yán)格監(jiān)控，小鼠可以任意飲水和取食(標(biāo)準(zhǔn)食物)，連續(xù)染毒60 d。

1.3 樣品處理及鉛濃度分析

染毒結(jié)束后處死小鼠，取睪丸組織樣品0.2～0.3 g，置于100 mL聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，樣品中分別加入 5 mL HNO3，2 mL H2O2，浸泡 30 min 后，入微波爐中，消解結(jié)束后取出至室溫，用Mili-Q超純水將樣品定容20 mL定容上機(jī)測(cè)定。Agilent 7500ce型ICP-MS檢測(cè)器測(cè)定Pb的濃度，Ge為內(nèi)參，檢出限為12 ng/L。

1.4 精液質(zhì)量分析

每只小鼠的附睪放入盛有1 mL 0.9%生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪將附睪縱向剪1～2刀，靜止3～5 min，輕輕搖動(dòng)，使精液液化。

1.4.1 精子活動(dòng)力的分級(jí)測(cè)定:WHO建議將精子活動(dòng)力分為4級(jí)［3］。a.快速前向運(yùn)動(dòng);b.慢或呆滯的前向運(yùn)動(dòng);c.分前向運(yùn)動(dòng);d.不動(dòng)。其操作方法:取液化均勻的精液1滴置于載玻片上，蓋上蓋玻片，放置片刻，在高倍鏡下觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子并進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算每類(lèi)精子的數(shù)量，以百分率表示。

1.4.2 精子畸形率測(cè)定:取液化均勻的精液，用4層擦鏡紙過(guò)濾，吸濾液涂片?？諝飧稍锖?，用甲醇固定5 min以上干燥。用1% ～2%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥。在高倍鏡下觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子中著色和不著色的精子數(shù)即為精子存活率。1.4.3 精子密度測(cè)定:取液化均勻的精液1滴，置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在高倍視野下，計(jì)數(shù)細(xì)胞板中間有25個(gè)方格(每個(gè)方格中又有16個(gè)小方格)的精子總數(shù)×106mL，即為精子密度。

1.4.4 精子存活率測(cè)定:取液化均勻的精液1滴置于載玻片上，1滴精液加等量的5%伊紅Y(用pH 7.4的磷酸緩沖液配制)混勻，2 min后推成薄片，自然干燥片刻，鏡檢?；罹硬恢?，死精子著紅色。在高倍鏡下觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子中著色和不著色的精子數(shù)即為精子存活率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析計(jì)量資料的組間差異，采用單因素方差分析(ANOVA)Scheffe’s多重比較;計(jì)數(shù)資料的組間差異，采用χ2分析;對(duì)于鉛暴露小鼠睪丸組織中鉛含量與精子活動(dòng)率、精子畸形率、精子密度和精子存活率的相關(guān)關(guān)系采用線性回歸分析(linear regression analysis)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠睪丸組織鉛濃度

對(duì)照組小鼠睪丸組織鉛濃度為9.73 ng/g，而0.5 g/L、1.0 g/L 和 1.5 g/L 染鉛組小鼠睪丸組織鉛濃度分別為 72.71 ng/g，118.74 ng/g 和 177.14 ng/g，各實(shí)驗(yàn)組鉛濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，并隨染毒劑量增加而升高(圖1)。

圖1 染鉛小鼠睪丸組織鉛濃度(ng/g)Fig 1 Concentration of Pb in the testis of mice exposed to Pb

2.2 醋酸鉛對(duì)精子質(zhì)量的影響

如表1所示，亞慢性染鉛組小鼠精子的密度和存活率顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，而染鉛組小鼠精子的畸形率顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，其中1.5 g/L染鉛組小鼠精子的密度和存活率降低和畸形率增高最為明顯。如表2所示，亞慢性染鉛組小鼠精子的活動(dòng)度顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。即染鉛組小鼠的慢或呆滯的前向運(yùn)動(dòng)或不動(dòng)的精子數(shù)顯著增多，而快速前向運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)顯著少于對(duì)照組。尤其1.5 g/L染鉛組小鼠精子的活動(dòng)度降低最為明顯。

2.3 小鼠睪丸鉛蓄積與精子質(zhì)量降低之間的關(guān)聯(lián)性

如圖2所示，醋酸鉛暴露小鼠睪丸鉛濃度與精子活動(dòng)率之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.0001)，其回歸方程為y= -0.14x+95.16。而醋酸鉛暴露小鼠睪丸鉛濃度與精子的密度、活力和存活率之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.0001)，其回歸方程分別為 y=-0.012x+4.98、y= - 0.14x+95.16 和 y=-0.13x+97.49。

表1 醋酸鉛暴露小鼠精子的密度、存活率和畸形率Tab 1 Density and survival，and malformation rate of Sperm in testes of mice exposed to Pb acetate (±s)

表1 醋酸鉛暴露小鼠精子的密度、存活率和畸形率Tab 1 Density and survival，and malformation rate of Sperm in testes of mice exposed to Pb acetate (±s)

1)與對(duì)照組比較，P＜0.01;2)與0.5 g/L 組比較，P ＜0.01;3)與1.0 g/L 組比較，P ＜0.01#:血球計(jì)數(shù)板中間方格精子數(shù)×106mL;*:每個(gè)樣本計(jì)數(shù)1000個(gè)精子

組別 精子密度(數(shù)目 ×106/mL，n=15)#精子存活率(%，n=15)*精子畸形率(%，n=15)*96.6 ±0.80 7.0 ±0.01 0.5 g/L 4.16 ×106 ±0.231) 90.5 ±0.551) 15.2 ±0.03 1.0 g/L 3.26 ×106 ±0.481)2) 81.1 ±0.801)2) 32.8 ±0.051)2)1.5 g/L 2.91 ×106 ±0.281)2) 71.4 ±0.491)2)3) 35.8 ±0.021)2)對(duì)照組 5.19×106±0.46

表2 醋酸鉛暴露小鼠精子活力Tab 2 Sperm activity in testis of mice exposed to Pb acetate (±s)

表2 醋酸鉛暴露小鼠精子活力Tab 2 Sperm activity in testis of mice exposed to Pb acetate (±s)

1)與對(duì)照組比較，P＜0.01;2)與0.5 g/L 組比較，P ＜0.01;3)與1.0 g/L 組比較，P ＜0.01

組別 WHO 精子活動(dòng)度分級(jí) 精子活動(dòng)度(%，n=15)I II III IV (I+II+III)/(I+II+III+IV)55 ±1.3 19 ±1.6 21 ±1.9 6 ±1.6 94.1 ±1.6 0.5 g/L 47 ±1.4 21 ±0.6 21 ±1.9 13 ±2.41) 87.3 ±1.61)1.0 g/L 43 ±0.81)2) 19 ±0.8 18 ±0.8 21 ±3.51)2) 79.2 ±1.51)2)1.5 g/L 37 ±0.71)2)3) 16 ±1.21)2)3) 16 ±1.11) 32 ±1.51)2)3) 68.3 ±1.11)2)3)對(duì)照組

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均顯示，鉛暴露對(duì)精子的發(fā)育、成熟均具有明顯的抑制作用。Telisman等［4］對(duì)101名接觸鉛工人進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血鉛與精液量、精子密度、精子活力和精子活率呈明顯負(fù)相關(guān)。Cullen等［5］對(duì)7名臨床診斷為鉛中毒患者的精液檢查發(fā)現(xiàn)，包括2名少精液癥和2名無(wú)精子癥在內(nèi)，有5名患者在精子發(fā)生、發(fā)育方面存在缺陷，但血中T和催乳素等激素水平均無(wú)明顯變化。Wadi等［6］用含不同濃度鉛的飲水飼養(yǎng)雄性成熟小鼠6周，結(jié)果顯示鉛暴露組附睪內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，精子數(shù)量和活動(dòng)精子所占比例降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞慢性染鉛組小鼠精子的密度和存活率及活動(dòng)度顯著低于對(duì)照組，尤其高劑量染鉛組小鼠的精子中不動(dòng)的精子數(shù)量明顯增多。另外，染鉛組小鼠精子的畸形率顯著高于對(duì)照組，并呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，與上述文獻(xiàn)的結(jié)果一致。然而，鉛暴露對(duì)精子的發(fā)生、發(fā)育的毒作用機(jī)制并不十分清楚。

圖2 醋酸鉛暴露小鼠睪丸鉛蓄積與精子質(zhì)量降低之間的相關(guān)性分析Fig 2 Correlation analysis between testicular lead accumulation and the decreased sperm quality in mice exposed to Pb acetate

睪丸組織與流經(jīng)睪丸的血液之間有一個(gè)防護(hù)層，稱(chēng)為血睪屏障 (blood-testis barrier)。一般認(rèn)為，該屏障具有阻止有害物質(zhì)通過(guò)和防止生殖細(xì)胞損傷等重要生理功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鉛暴露組小鼠睪丸組織鉛濃度顯著高于對(duì)照組，并隨染毒劑量增加而升高。而且，鉛暴露小鼠睪丸鉛濃度與精子的活動(dòng)率、密度和存活率之間呈顯著負(fù)相關(guān)。Naha等［7］報(bào)道，接觸鉛工人精液中鉛濃度明顯升高。Telisman等［8］也報(bào)道，接觸鉛工人精液中的鉛濃度與精子的密度和活力呈顯著負(fù)相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，亞慢性鉛暴露小鼠可導(dǎo)致小鼠睪丸組織鉛蓄積。而且，鉛在睪丸組織蓄積可能是亞慢性暴露小鼠精子質(zhì)量下降的重要因素。今后有必要進(jìn)一步深入研究?jī)烧咧g的密切關(guān)聯(lián)性。

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Effect of subchronic exposure to lead on sperm quality of mice and accumulation of lead in the testis

JIN He-tian1，WANG Xiao-xu2，PIAO Feng-yuan2
(1.Centre of Radiotherapy，the202Hospital of Shenyang，Shenyang110000，China;2.Department of Occupational and Environmental Health，College of Public Health，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo observe effect of subchronic exposure to lead(Pb)on sperm quality of mice and accumulation of Pb in the testis.MethodsSixty mice were divided into 4 groups of 15 each.Group 1 received drinking water alone(control).Group 2，3 and 4 received 0.5，1.0 and 1.5 g/L Pb acetate respectively.Pb acetate was given through drinking water.On the 60th day after Pb exposure，mice were decapitated and the epididymis and testis were taken.After the treatment，the concentration of Pb was determined in testis of mice by inductively coupled plasma-mass spectrometry(ICPMS)and the sperm quality was observed by microscope.The correlation between concentration of Pb in testis and toxic effect of it on the sperm quality was also analyzed by Linear regression analysis.ResultsThe activity of sperm in mice was 9.73 ng/g in control group and 87.3%，79.2%，and 68.3%respectively in the 0.5，1.0 and 1.5 g/L Pb acetate groups.The activity of sperm was significantly lower in the experimental groups than that in controls(P＜0.05).The sperm malformation rate was 15.2%，32.8%and 35.5%in the groups exposed to Pb and significantly increased compared with control group(7.0%)(P＜0.05).Concentration of Pb in the testis was 72.71，118.74，and 177.14 ng/g respectively in the 3 experimental groups and significantly higher than that in control group(9.73 ng/g)(P＜0.05).Moreover，there was significant negative correlation between the Pb concentration in testis and density，survival rate，and viability of sperm in mice exposed to Pb.ConclusionThe subchronic exposure to Pb can induce the accumulation of Pb in the testis of mice.It indicates that the accumulated Pb in testis may be responsible for the decreased sperm quality in mice exposed to Pb.

［Key words］lead acetate;male reproductive toxicity;lead accumulation;sperm quality

R114

A

1671-7295(2013)02-0108-04

金河田，王曉旭，樸豐源.亞慢性鉛暴露小鼠睪丸組織鉛蓄積及對(duì)精子質(zhì)量影響［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(2):108 -111.

10.11724/jdmu.2013.02.02

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172719)

金河田(1960-)，男，遼寧沈陽(yáng)人，副主任醫(yī)師。

樸豐源，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:piaofy_dy@yahoo.com.cn

2013-01-09;

2013-03-15)