穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒 馬曉明 徐紹鋼 劉心亮 劉文赫

廣州中醫(yī)藥大學附屬深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518033

腦缺血再灌注后，腦血管新生在腦組織損傷后結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)功能恢復中發(fā)揮著重要作用。針刺任督脈經(jīng)穴對腦缺血的治療作用有多靶點、多層次、多水平等特點，對腦缺血后神經(jīng)再生具有積極的效應[1]?；谇捌谘芯炕A，本研究擬觀察針刺任督脈經(jīng)穴對腦缺血血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白和CD34表達的影響，探討針刺任督脈經(jīng)穴治療腦缺血再灌注的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康雄性 SD 大鼠54只，體重（220±20）g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK（粵）2008-0002。大鼠飼料為廣東省實驗動物中心提供的富含多種成分的配方。飼養(yǎng)于深圳市中醫(yī)院中心實驗室提供的動物房，環(huán)境溫度26℃，濕度6%。

1.2 大鼠MCAO模型的建立

參考Kuge等[2]造模法，按 300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉，消毒剃毛后在蔡司體視顯微鏡下，銳鈍結(jié)合分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），應用日本制尼龍線（直徑 0.205 mm）插入ICA阻斷CCA血流，缺血2 h后拔出線栓形成缺血再灌注。再灌后參考Longa神經(jīng)病學評分[3]評定大鼠神經(jīng)功能缺損，評分為1～4分則表示造模成功，可用于實驗。

1.3 實驗動物電針方法

針刺任督脈組大鼠在術后第2天起給予針刺，穴位選取任脈穴位承漿、氣海、關元及督脈穴位百會、水溝和大椎，共6穴，穴位定位參照《實驗針灸學》[4]中以上6個穴位取穴標記的方法，針刺后予SDZ-Ⅱ型華佗牌電針儀加電，疏密波刺激（疏波 30 Hz，密波 100 Hz），強度 5 V，以身體相應部位出現(xiàn)輕微顫動為準。持續(xù)時間為20 min。假手術組和模型組大鼠于術后第2天將其同其余實驗組大鼠般固定于針刺操作臺上20 min，不給予針刺。每天1次，分別于術后的第7、14、28天處死。

1.4 取材

各組的大鼠在各個時間點經(jīng)麻醉后，先予生理鹽水心臟灌注，再予4%多聚甲醛心臟灌注后固定，冠狀石蠟切片，片厚10 μm。微波爐抗原修復，兔抗VEGF一抗或兔抗CD34一抗 （北京博奧森生物技術有限公司）4℃過夜，PBS沖洗，滴加即用型MaxvisionTM試劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡200×視野觀察照相。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物分組

將54只實驗動物隨機分為假手術組、模型組及針刺任督脈組。各組分別隨機分為7 d組、14 d組和28 d組3個亞組，每亞組6只。

2.2 針刺任督脈對腦缺血VEGF表達的影響

結(jié)果表明，假手術組3個時間點的VEGF表達平均灰度值相當，均為189左右，提示其陽性細胞數(shù)相當 （P>0.05）。模型組和針刺任督脈組隨著缺血再灌注時間的延長，其平均灰度值逐漸增多，模型組7 d時最低（169.97±2.42），14 d 時增多 （175.83±1.72），28 d 時最高 （179.00±2.19），同樣的針刺任督脈組 7 d 時最低（155.50±2.70），14 d 時增多（165.67±1.90），28 d 時最高（169.83±2.40）。假手術組、模型組VEGF的表達在7、14及28 d差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P<0.01）；假手術組、針刺任督脈組VEGF的表達在7、14 d及28 d差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。提示VEGF蛋白陽性細胞逐漸減少，但相對于模型組，針刺任督脈組數(shù)值上有明顯優(yōu)勢（P<0.05）。

2.3 針刺任督脈對腦缺血CD34表達的影響

實驗結(jié)果表明，假手術組3個時間點比較，其CD34表達平均灰度值相當，提示其陽性細胞數(shù)相當（P>0.05）。模型組和針刺任督脈組在腦缺血再灌注7 d時其CD34表達平均灰度值明顯減少，14 d時最低峰，28 d時又增多，提示與假手術組比較，模型組和針刺任督脈組CD34陽性細胞數(shù)明顯增多，14 d時達高峰后逐漸減少，但相對于模型組，針刺任督脈組數(shù)值上有明顯優(yōu)勢（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠CD34表達的平均灰度值（±s，n=6）

表1 各組大鼠CD34表達的平均灰度值（±s，n=6）

注:與假手術組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

組別 只數(shù) 7 d 14 d 28 d假手術組模型組針刺任督脈組181818200.00±2.37180.17±2.79①164.17±2.99②200.83±2.23164.17±2.86①144.83±2.48②199.67±2.66180.00±2.61①163.50±2.88②

3 討論

腦缺血再灌注損傷后，及早恢復缺血半暗帶區(qū)血供及促進新生的微血管和側(cè)支循環(huán)的重建，有利于改善腦缺血情況，減少神經(jīng)元凋亡壞死。因此，血管新生成為腦缺血后治療的關鍵環(huán)節(jié)之一，可通過藥物或其他途徑促進缺血組織在原有微血管基礎上形成新的毛細血管，并和原血管網(wǎng)相交匯以利于改善血供[5-6]。大量研究[7-8]表明，腦缺血缺氧可誘導VEGF、CD34及其受體的上調(diào)表達，并激活其血管再生和保護神經(jīng)元機制。VEGF作為一種內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂原，通過和其受體結(jié)合而促進內(nèi)皮細胞增殖，加速血管新生和提高血管通透性；而CD34（內(nèi)皮前體細胞，EPCs）能分化為內(nèi)皮細胞，定向遷移到缺血或損傷部位并參與局部的血管新生[9]。VEGF對EPCs的活性具有重要的作用，在缺血缺氧條件下可動員EPCs[10-12]。針刺任督脈提高了VEGF和CD34的表達，從而促進血管新生，提高血管通透性，因此，探討腦缺血后VEGF和CD34表達情況及電針對其干預作用意義重大。

從中醫(yī)角度上看，任脈為陰脈之海，主妊養(yǎng)生殖；而督脈為陽脈之海，主統(tǒng)率陽氣。針刺任督脈研究在針灸治療中風的應用也越來越深入，在治療上也取得了令人滿意的療效[13]。前期研究表明，針刺任督脈穴位可持續(xù)性促進腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖分化為神經(jīng)元[14]，針刺任脈經(jīng)穴可持續(xù)性上調(diào)腦內(nèi)一系列神經(jīng)生長因子的表達[15]，而針刺督脈可抑制神經(jīng)元凋亡[16]。而以上這一系列的結(jié)果，可能與促進局部微血管新生有關。本研究結(jié)果表明，針刺任督脈治療在腦缺血再灌注7 d可分別上調(diào)腦內(nèi)VEGF蛋白和CD34表達，提示針刺任督脈治療腦缺血，可能通過上調(diào)VEGF蛋白和CD34表達，促進微血管新生，這可能為其抗腦缺血再灌注損傷的作用機制之一。

[1]楊卓欣，陳鵬典，于海波，等.針刺任督脈穴位促進腦缺血后神經(jīng)再生的研究近況[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2012，10（1）:19-24.

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