安 陽(yáng) 邱寶安 趙文超

解放軍海軍總醫(yī)院肝膽外科，北京 100048

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是膽管癌病變進(jìn)展中的重要生物學(xué)行為，也是患者死亡的重要原因。Kiss-1和上皮黏附素（E-cadherin）高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的惡變及轉(zhuǎn)移有抑制作用[1]。TWIST能通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)膽管癌中TWIST、Kiss-1和E-cadherin的表達(dá)情況，探討TWIST、Kiss-1和E-cadherin與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在為揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇膽管癌根治術(shù)切除后留取的蠟塊組織109例作為觀察組，均符合WHO中關(guān)于膽管癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并由病理主治醫(yī)師閱片再次確認(rèn)。本組患者年齡為46～76歲，平均（55.4±2.5）歲，其中男 58例，女 51例，術(shù)前均未進(jìn)行放化療，同時(shí)選取病理證實(shí)為正常膽管黏膜組織70例作為對(duì)照組，年齡為 46～75 歲，平均（55.1±3.7）歲，其中男 35 例，女35例。兩組在性別、年齡等一般資料上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白表達(dá)的檢測(cè)

TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，檢測(cè)應(yīng)用免疫組化SP法，應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，由病理科主管技師進(jìn)行操作，并在顯微鏡下進(jìn)行顯色，嚴(yán)格質(zhì)量控制，減少人為誤差。

1.3 結(jié)果判定方法

結(jié)果的判斷均由兩位病理主治醫(yī)師共同閱片得出。Kiss-1和E-cadherin陽(yáng)性染色均位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜，呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，合并計(jì)算高倍鏡下（400×）隨機(jī)選擇的10個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞占全部計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的百分率，平均每個(gè)視野呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，無(wú)明顯陽(yáng)性反應(yīng)或陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并進(jìn)行線性相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白在膽管癌及正常膽管黏膜組織中的表達(dá)

TWIST在膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而Kiss-1和E-cadherin在膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白的表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系

TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白在膽管癌不同分化程度、浸潤(rùn)深度及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 膽管癌中TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行線性相關(guān)分析顯示，觀察組中TWIST和 Kiss-1（r=-0.45，P=0.0198）、TWIST 和 E-cadherin（r=-0.48，P=0.0095）的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，而Kiss-1和 E-cadherin 的表達(dá)具有正相關(guān)性（r=0.44，P=0.0130）。

3 討論

腫瘤進(jìn)展過(guò)程中出現(xiàn)基因和蛋白表達(dá)的異常，其中抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤增殖失控性增生、浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。TWIST基因是一種高度保守的堿性螺旋轉(zhuǎn)錄因子，最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是HLH超家族的成員，參與機(jī)體的多種調(diào)節(jié)過(guò)程[3-4]。尤其是中胚層發(fā)育及形態(tài)形成過(guò)程及誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)及組織塑形中起重要作用[5-6]。E-cadherin是鈣依賴的黏附素家族的一個(gè)經(jīng)典成員。在腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，黏附起到重要作用。近年來(lái)，有關(guān)緊密連接蛋白及黏附分子功能的研究日趨增多，并證實(shí)了其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用[7]。Kiss-1是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，也是應(yīng)用微細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)在黑色素細(xì)胞株中提取并分離的，Kiss-1定位于染色體1q32，包括4個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)生54個(gè)氨基酸。正常情況下Kiss-1在正常黏膜中高表達(dá)，對(duì)抑制腫瘤向周圍組織浸潤(rùn)有重要作用，而當(dāng)其表達(dá)下降時(shí)，Kiss-1對(duì)腫瘤增生及浸潤(rùn)的抑制作用下降，引發(fā)腫瘤惡性生長(zhǎng)的生物學(xué)行為。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)膽管癌中TWIST、Kiss-1和E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果顯示TWIST在膽管癌組織中高表達(dá)，Kiss-1和E-cadherin在膽管癌組織中低表達(dá)，提示三種蛋白均與膽管癌細(xì)胞的惡變有關(guān)。結(jié)果顯示TWIST、Kiss-1和E-cadherin在不同分化、不同浸潤(rùn)深度、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)有明顯的差異，提示三種蛋白可能參與了腫瘤的進(jìn)展，即TWIST、Kiss-1和E-cadherin異常表達(dá)后參與了腫瘤的分化過(guò)程及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程，使腫瘤遷移能力增強(qiáng)。TWIST、Kiss-1和E-cadherin參與了腫瘤的分化，由于腫瘤的分化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中最重要的階段，也說(shuō)明了TWIST、Kiss-1和E-cadherin對(duì)腫瘤的分化起核心作用。由于分化、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與患者的預(yù)后相關(guān)，因此，三種蛋白可能與預(yù)后有一定關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TWIST、Kiss-1和E-cadherin具有相關(guān)性，提示三種蛋白具有協(xié)同作用，即TWIST不僅具有調(diào)節(jié)以E-cadherin為主的黏附作用[8-9]，還具有調(diào)節(jié)Kiss-1的作用，使腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)[10]。惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件是癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶，而在此過(guò)程中起作用是的異常表達(dá)的E-cadherin[11-13]，當(dāng)TWIST對(duì)其調(diào)節(jié)作用下降時(shí)，使腫瘤細(xì)胞間的黏附作用下降，腫瘤細(xì)胞易于離開(kāi)原發(fā)灶，在遠(yuǎn)隔器官進(jìn)行定植，形成轉(zhuǎn)移癌[14-15]。在此過(guò)程中TWIST調(diào)節(jié)的Kiss-1也可以改變細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的完整性。因此Kiss-1和E-cadherin的表達(dá)缺失以及TWIST的表達(dá)增加是促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要因素，使腫瘤抑制基因與細(xì)胞外基質(zhì)降解形成了一個(gè)協(xié)同的過(guò)程，共同參與腫瘤的發(fā)展。

總之，TWIST、Kiss-1和E-cadherin異常表達(dá)在膽管癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，三者具有協(xié)同效應(yīng)，共同促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

表1 TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白在膽管癌及正常膽管黏膜組織中的表達(dá)[n（%）]

表2 TWIST、Kiss-1和E-cadherin蛋白的表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

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