蘆 鑫 朱巧梅 孫 強(qiáng) 張麗霞 宋國輝 黃紀(jì)念

(河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工所1，鄭州 450002)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，鄭州 450002)

花生是世界重要的油料作物之一。我國是花生的生產(chǎn)大國，花生產(chǎn)量居世界首位［1］。由于花生營養(yǎng)豐富，且適于多種烹飪加工方式處理，所以深受我國居民的喜愛，因而我國也是花生的消費(fèi)大國。目前，我國60%的花生資源用于制作花生油［2］。我國居民對濃香型花生油的嗜好性消費(fèi)決定了花生制油中常有高溫烘烤增香工藝，由此產(chǎn)生大量的高溫壓榨花生餅粕。

高溫壓榨花生餅粕中含有50%左右花生蛋白［3］。研究表明，花生蛋白營養(yǎng)價(jià)值高，且抗?fàn)I養(yǎng)因子少，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源之一［4］。由于高溫處理使花生蛋白變性造成高溫壓榨花生粕中蛋白難于提取利用，因此目前我國高溫壓榨花生餅粕主要用作飼料和肥料，造成資源浪費(fèi)。蛋白經(jīng)過酶解生成肽可以提高溶解性、乳化性、起泡性等功能性，此外某些肽還具有生理活性如抗氧化性、降血壓、降血糖等，因此蛋白酶解制備多肽成為蛋白加工的熱點(diǎn)［5－6］。國內(nèi)外開展以花生蛋白為原料制備花生活性肽的研究，目前研究的結(jié)果表明花生活性肽多具有抗氧化活性［7－9］。但現(xiàn)有的研究中多以低溫花生餅粕或直接從花生籽中提取花生蛋白酶解制備抗氧化肽，高溫壓榨花生餅粕研究較少。因此，本研究以高溫壓榨花生餅粕為原料提取花生蛋白，采用多種商業(yè)蛋白酶對其水解，篩選出最適制備花生活性肽的蛋白酶，并優(yōu)化其水解條件，以便為高溫花生餅粕的加工利用拓展新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫壓榨花生餅粕［蛋白質(zhì) (54.85±0.79)%，含水量(6.53 ±0.09)%，油脂(5.63 ±0.24)%，灰分(4.90±0.16)%］:開封包公食品有限公司;堿性蛋白酶2709［酶活(225 303.48 ±22.53)U/g］、Alcalase［酶活(7 232.55 ±76.33)U/g］、木瓜蛋白酶［酶活(4 831.91 ±42.98)U/g］、菠蘿蛋白酶［酶活(17 540.22 ±38.42)U/g］、胰蛋白酶［酶活(21 571.36 ±12.23)U/g］:鄭州分子科貿(mào)有限公司;牛血清白蛋白、2，4，6 － 三硝基苯磺酸(TBNS)、考馬斯 G250:美國sigma公司;其他試劑:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

K－05型自動(dòng)定氮儀:上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司;Lyovac GT1冷凍真空干燥機(jī):德國SRK系統(tǒng)技術(shù)有限公司;DL－5－B離心機(jī)、TGL－16A離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;XS205電子天平:梅特勒－托利多儀器有限公司;DF－101S集熱兼磁力加熱攪拌器:鞏義市予華儀器有限公司;DNM－9606酶標(biāo)分析儀:北京普朗新技術(shù)有限公司;UV－6300雙光束紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生蛋白的提取

高溫壓榨花生餅粕粉碎至100目，加入到正已烷中，80～90℃加熱回流3 h，濾除溶劑。稱取一定量的脫脂花生餅粕粉加入到蒸餾水中，兩者比例為1∶10，磁力攪拌下用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)到pH 10.0，室溫?cái)嚢? h，采用4 000 r/min離心20 min，收集上清液，將沉淀再次加入到相同體積蒸餾水并調(diào)節(jié)到pH 10.0，重復(fù)上述攪拌和離心操作，合并第1次和第2 次上清液，采用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)到 pH 4.30，4 ℃靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，并水洗至中性，冷凍干燥，粉碎至100目，得到花生蛋白。干基花生蛋白的純度為(94.50±0.15)%。

1.2.2 酶解反應(yīng)

配制一定濃度的花生蛋白溶液，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH，放入集熱兼磁力加熱攪拌器中，使其溫度到達(dá)設(shè)定值，加入一定濃度蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。水解過程中，持續(xù)攪拌并保持pH恒定，反應(yīng)完畢后，采用95℃加熱10 min滅酶，冷卻，采用8 000 r/min離心15 min，收集上清液，取部分測定水解度和抗氧化活性，余下冷凍干燥。

1.2.3 蛋白酶篩選

結(jié)合文獻(xiàn)和說明書，菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase、堿性蛋白酶2709酶解花生蛋白的條件見表1，測定上清液中的蛋白水解度和抗氧化活性。

表1 不同蛋白酶酶解花生蛋白的條件

1.2.4 蛋白酶水解工藝優(yōu)化

對篩選出的工具酶，采用單因素試驗(yàn)確定其加酶量和花生蛋白濃度范圍?？疾旒用噶坑绊憰r(shí)，固定酶解溫度為50℃，水解時(shí)間2 h，蛋白濃度固定5%，pH 9.5，加酶量依次取 5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 U/g蛋白。

在此基礎(chǔ)上，找到合適的加酶量范圍?；ㄉ鞍诐舛裙潭ㄔ?%，采用響應(yīng)面繼續(xù)優(yōu)化酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量。

1.2.5 蛋白濃度測定

酶解液中蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)G－250，測定波長為595 nm，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白［10］。

1.2.6 水解度測定

取0.25 mL上清液加入到試管中，隨后加入2 mL，0.1%的 TNBS 和2 mL，0.2 mol/L，pH 8.20 磷酸緩沖液，置于水浴鍋中50℃水浴振蕩60 min，水浴過程中，采用鋁箔覆蓋遮光。隨后用4 mL 0.1 mol/L的鹽酸進(jìn)行終止反應(yīng)，室溫靜置30 min，以L－亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用340 nm測定吸光度［11］。蛋白水解度(DH)計(jì)算公式如下:

式中:h為水解物每克被裂解的肽鍵量/mmol/g;htot為每克原料蛋白質(zhì)的總的肽鍵量/mmol/g?；ㄉ鞍椎?htot為 7.49 mmol/g［12］。

1.2.7 抗氧化能力的測定

參照Zainol等［13］硫氰酸鐵法，并略加修改。取一定體積的上清液加入10 mL 50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液和10 mL 1.3%的亞油酸乙醇溶液，定容到25 mL，置于40℃暗室中反應(yīng)10 min。從中取80 μL溶液，加入100 μL 1%的KSCN乙醇溶液和100 μL 1.3 mmol/L FeCl2乙醇溶液于酶標(biāo)板中，測定波長為492 nm。抗氧化能力計(jì)算公式如下:

式中:AA為抗氧化能力;A0為空白吸光度;As為加抗氧化劑的樣品吸光度。本次試驗(yàn)中測定抗氧化性時(shí)，蛋白濃度為5 mg/mL。

1.2.8 成分測定方法

蛋白測定采用凱氏定氮法GB 5009.5—2010，N為5.46;灰分測定采用550℃灰化法GB/T 5505—2008;水分測定采用105℃恒重法GB5512—1985;粗脂肪測定采用索氏抽提法GB/T 14772—2008。蛋白酶酶活標(biāo)定采用Folin法SB/T 10317—1999。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

無特殊說明，所有試驗(yàn)平行測定3次，采用SPSS Statistics 19進(jìn)行Duncan算法的單因素方差分析，SAS9.1.3進(jìn)行 Box－Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析。顯著水平為0.05，高度顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對花生抗氧化肽制備的影響

蛋白酶是制備活性肽的重要因素，由于不同蛋白酶水解蛋白質(zhì)作用位點(diǎn)不同，從而造成蛋白水解程度和多肽活性有所差異。由圖1a所示，水解時(shí)間在0～3 h期間，水解度快速增加，隨后水解度變化趨于平緩。其中堿性蛋白酶2709和Alcalase水解花生能力較強(qiáng)，菠蘿蛋白酶水解能力最弱。由于采用的花生蛋白來源于高溫壓榨花生餅粕，該花生蛋白經(jīng)過高溫處理，蛋白變性伸展程度高，水解位點(diǎn)暴露容易被酶水解，且加酶量較高，這可能是本次試驗(yàn)中水解度較高的原因。由圖1b所示，不同蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性存在明顯差異，但抗氧化活性隨時(shí)間變化趨勢相似，即水解時(shí)間60 min內(nèi)，抗氧化活性迅速上升，隨后有所下降，這與陳貴堂等［6］的研究結(jié)果一致。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)采用Neutrase、As1.398中性蛋白酶水解花生蛋白可以產(chǎn)生抗氧化肽［7，14］。本次研究中5種蛋白酶酶解花生蛋白均可產(chǎn)生抗氧化肽，這表明花生蛋白適宜作為制備抗氧化肽的原料。

圖1 蛋白酶種類對水解花生蛋白的DH和AA的影響

觀察水解度和抗氧化活性可以發(fā)現(xiàn)，水解度較低時(shí)，具有抗氧化活性的多肽生成較少，則抗氧化活性較低;但水解度過高，具有抗氧化活性的肽被降解，破壞了產(chǎn)生抗氧化活性的基團(tuán)，造成抗氧化活性降低，這可能是堿性蛋白酶2709酶解產(chǎn)物抗氧化活性在后續(xù)水解中有大幅下降而胰蛋白酶酶解產(chǎn)物抗氧化活性減低較為平緩的原因。雖然胰蛋白酶水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但其成本較高，因此，選擇堿性蛋白酶2709作為水解花生蛋白的工具酶。此外，通過分析水解時(shí)間對抗氧化的影響可知，要獲得高活性的抗氧化肽水解時(shí)間應(yīng)控制在2 h以內(nèi)。

2.2 堿性蛋白酶2709加酶量對花生抗氧化肽制備的影響

由圖2可知，酶解時(shí)間一定時(shí)，伴隨著加酶量的增加，花生蛋白的水解度呈現(xiàn)上升趨勢，但當(dāng)加酶量大于15 000 U/g蛋白時(shí)，繼續(xù)增加加酶量對花生蛋白的水解度無顯著影響。這是由于適當(dāng)增加蛋白酶濃度可以增加酶與底物作用位點(diǎn)接觸機(jī)率，從而加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行，但在一定體系內(nèi)，花生蛋白中可以被蛋白酶作用的位點(diǎn)數(shù)目有限，當(dāng)這些位點(diǎn)都參與酶解反應(yīng)時(shí)，水解速度達(dá)到平衡，水解度不在隨加酶量的增加而上升。觀察酶解產(chǎn)物的抗氧化性可以發(fā)現(xiàn)，加酶量在5 000～10 000 U/g蛋白之間時(shí)，酶解產(chǎn)物的抗氧化性呈現(xiàn)上升趨勢，繼續(xù)增加加酶量反而降低了抗氧化性。這是由于在相同的酶解時(shí)間內(nèi)，高加酶量的體系中，花生蛋白水解程度高于低加酶量的樣品，過度的水解造成抗氧化肽的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致抗氧化活性降低?？紤]抗氧化性，可以將加酶量確定為5 000～15 000 U/g蛋白之間。

圖2 堿性蛋白酶2709加酶量對花生蛋白酶解物DH和AA的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化酶解條件

2.3.1 酶解條件對水解度的影響

采用SAS響應(yīng)面分析水解度數(shù)據(jù)(表2)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)模型高度顯著(P=0.000 1)，這說明采用二次曲面模型適合模擬客觀情況;失擬項(xiàng)不顯著(P=0.061 7)，這表明沒有遺漏重要的影響因子，選取的酶解因素全面;R2=98.34%，調(diào)整 R2=96.41%，這說明響應(yīng)面模型和實(shí)際結(jié)果擬合程度高。

分析影響因素，酶解pH、酶解時(shí)間和加酶量是高度顯著影響因素(P＜0.01)，而酶解溫度是非顯著影響因素(P=0.148 7)。酶解溫度是非顯著影響因素的原因可能與酶解溫度取值區(qū)間較窄有關(guān)。獲得的擬合曲線如下:

水解度 =144.15 －13.99X1+1.78X2－4.04X3+4.8 × 10－4X4+0.81X12+0.19X1X2+0.03X1X3+4.2 ×10－5X1X4+0.02X22－0.9 ×10－2X2X3+0.28 ×10－3XX+0.04X2－1.1 ×10－5XX+1.85 ×10－9X42

表2 響應(yīng)面優(yōu)化制備抗氧化花生肽試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件和結(jié)果

圖3 酶解因素對花生蛋白酶解物水解度的影響

由于酶解溫度是非顯著影響因素，固定酶解溫度為45℃，因此分析加酶量、pH和酶解時(shí)間對水解度的影響。固定酶解溫度為45℃，加酶量為10 000 U/g蛋白，pH不變考察酶解時(shí)間影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，伴隨著酶解時(shí)間延長，花生蛋白的DH逐漸上升，但隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DH上升速度有所降低。當(dāng)固定酶解時(shí)間，分析pH影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增加酶解體系的pH有利于花生蛋白DH增加，pH 10.5的酶解樣品具有最高的水解度(圖3a)。結(jié)果表明，由于體系pH會(huì)影響堿性蛋白酶2709在反應(yīng)體系中的構(gòu)象，從而帶來酶活差異，從而對蛋白水解產(chǎn)生影響。由圖3b反映加酶量和pH對花生蛋白DH的影響。當(dāng)固定pH，分析加酶量影響發(fā)現(xiàn)，增加加酶量會(huì)提高花生蛋白的DH。

2.3.2 酶解條件對抗氧化性的影響

研究表明:酶法制備抗氧化肽受多種因素的影響，如蛋白酶種類、底物種類、酶解程度等因素影響。分析表2中的抗氧化性結(jié)果發(fā)現(xiàn):模型高度顯著(P=0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.052 1)，R2=97.06%和調(diào)整R2=93.63%，因此采用響應(yīng)面模型可以真實(shí)客觀的反映酶解產(chǎn)物的抗氧化性。

在此基礎(chǔ)上，方差分析酶解因素發(fā)現(xiàn):pH、酶解時(shí)間和加酶量是高度顯著因素(P ＜0.01)，酶解溫度為非顯著影響因素(P=0.619 0)，獲得的回歸方程如下:

抗氧化性 = －1 424.27+149.56X1+109.76X2+26.76X3+0.02X4－6.62X12－5.87X1X2－0.08X1X3－1.12 ×10－3X1X4－8.33X22－0.12X2X3－2.01 ×10－3X2X4－0.28X32－1.2 ×10－5X3X4－2.38 ×10－7X42

響應(yīng)面圖4直觀反映了pH、酶解時(shí)間、加酶量和它們交互作用對抗氧化性的影響。如圖4a所示，當(dāng)固定酶解溫度為45℃，加酶量為10 000 U/g蛋白，pH保持不變觀察酶解時(shí)間對抗氧化性的影響發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間在1～2.1 h之間，增加酶解時(shí)間促進(jìn)抗氧化性提高，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，樣品抗氧化性有所降低。這是由于伴隨著酶解時(shí)間延長，水解度增加，具有抗氧化活性的多肽被進(jìn)一步水解，導(dǎo)致抗氧化性有所降低。固定酶解時(shí)間觀察pH對抗氧化性的影響發(fā)現(xiàn)，pH從8.5增加到9.5過程中，增加pH有利于酶解樣品抗氧化性的增加，而從9.5增加到10.5時(shí)，抗氧化活性有所下降。這是由于在低的pH條件下，堿性蛋白酶2709酶活較低，相同酶解時(shí)間下，花生蛋白水解程度較低，產(chǎn)生較少的抗氧化性肽，因此抗氧化性較低。而當(dāng)處于高的pH條件下，蛋白酶酶活高，花生蛋白過度水解，抗氧活性肽的功能基團(tuán)被破壞，導(dǎo)致活性有所下降。圖4b所示，當(dāng)固定pH時(shí)，增加加酶量有利于提高抗氧化性，過度添加蛋白酶會(huì)帶來抗氧化性下降。這是由于加酶量較少時(shí)，水解速度較低，相同時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生抗氧化性肽較少，從而抗氧化活性較低。當(dāng)加酶量較高時(shí)，體系內(nèi)酶濃度高，酶與蛋白底物反應(yīng)位點(diǎn)碰撞的機(jī)率增加，水解速度快，蛋白水解程度高，抗氧化活性肽可能被進(jìn)一步水解，降低抗氧化活性。

圖4 酶解因素對花生蛋白酶解物抗氧化能力的影響

2.3.3 水解度與抗氧化性關(guān)系

制備抗氧化活性肽的目的在于獲得高活性的酶解產(chǎn)物，但由于蛋白酶解反應(yīng)復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生多種酶解多肽產(chǎn)物。因此，需要通過水解度來推測酶解產(chǎn)物組成和檢控酶解反應(yīng)的程度。為了闡述抗氧化活性與水解度二者的關(guān)系，以酶解因素為自變量，水解度和抗氧化活性為應(yīng)變量，考察二者隨酶解因素變化及其二者之間的聯(lián)系(圖5)。

由圖5可知，伴隨著加酶量、pH、酶解時(shí)間的增加，水解度呈上升趨勢，而抗氧化活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。水解度和抗氧化活性的關(guān)系如下:當(dāng)水解度小于18%時(shí)，抗氧化活性伴隨著水解度增加，當(dāng)水解度處于18%至21%之間時(shí)，抗氧化活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢;當(dāng)水解度進(jìn)一步增加，抗氧化活性呈現(xiàn)快速下降。在取值范圍內(nèi)，抗氧化性存在最大值，預(yù)測的最大值為(70.71±1.24)%，對應(yīng)酶解條件為pH 9.42，酶解時(shí)間為1.98 h，酶解溫度為45 ℃，加酶量為 7 883.86 U/g蛋白。該條件下，水解度為(17.56±0.60)%。結(jié)合實(shí)際情況，確定獲得最高抗氧化活性的酶解條件為:酶解溫度45℃，加酶量為7 885 U/g蛋白，pH 9.40，酶解時(shí)間取 1.98 h，在此條件進(jìn)行水解，獲得抗氧化活性肽的水解度和抗氧化活性分別為(17.44 ±0.35)%和(70.2 ±0.63)%。

圖5 花生蛋白酶解物抗氧化能力與水解度關(guān)系

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，以高溫壓榨花生餅粕為原料提取的花生蛋白經(jīng)過酶法水解可以用于制備抗氧化活性肽?；ㄉ鞍酌附猱a(chǎn)物的抗氧化能力受蛋白酶種類和酶解工藝的影響。

初步采用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase和堿性蛋白酶2709水解花生蛋白分析酶解產(chǎn)物的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶和堿性蛋白酶2709具有較好的效果。結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，選用堿性蛋白酶2709作為制備花生抗氧化肽的工具酶。

以抗氧化活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶2709的酶解條件發(fā)現(xiàn)，加酶量、pH和酶解時(shí)間是高度顯著影響因素，酶解溫度為非顯著因素。獲得最佳酶解工藝:溫度45℃，加酶量7 885 U/g蛋白，pH 9.40，酶解時(shí)間取1.98 h，在此條件獲得抗氧化活性肽的水解度和抗氧化活性分別為(17.44±0.35)%和(70.2±0.63)%。同時(shí)，當(dāng)水解度控制在18%以下時(shí)，增加水解度有利于提高抗氧化活性，但水解度繼續(xù)上升，抗氧化活性反而有所下降。

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