張其剛 齊科雷 曲曉翰 許廣輝 劉洋 楊焱淼

MG是一種以骨骼肌無(wú)力為主要表現(xiàn)，由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的針對(duì)神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜乙酰膽堿受體的自身免疫性疾?。?］。胸腺是觸發(fā)并維持這種自身免疫反應(yīng)的場(chǎng)所，T淋巴細(xì)胞免疫異常在MG發(fā)病中占有重要地位。本研究通過(guò)檢測(cè)胸腺瘤患者血清和胸腺淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)變化以及基因結(jié)構(gòu)改變，對(duì)MG的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究和探討。

1 對(duì)象和方法

1.1 觀察對(duì)象 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科2000-01-01－2011-12-30 期間收治的胸腺瘤手術(shù)患者共131例，按是否合并MG分兩組。MG患者均以典型臨床癥狀加新斯的明試驗(yàn)和肌電圖檢查陽(yáng)性作為確診依據(jù)［2］，并通過(guò)病史和相關(guān)檢驗(yàn)如甲狀腺功能檢測(cè)、血細(xì)胞分析等排除MG以外的其他自身免疫性疾病。（1）胸腺瘤合并MG組：70例，其中男30例、女40例，平均年齡42.2歲。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型15例，AB型12例，B1型20例，B2型14例，B3型9例；按Masaoka胸腺瘤臨床分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期14例，Ⅳa期5例；按Osserman MG臨床分型，Ⅰ型25例，Ⅱa型20例，Ⅱb型16例，Ⅲ型7例，Ⅳ型2例。（2）胸腺瘤不合并MG組：61例，男30例、女31例，平均年齡45.6歲。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型13例，AB型13例，B1型17例，B2型12例，B3型6例；按 Masaoka胸腺瘤臨床分期，Ⅰ期26例，Ⅱ期21例，Ⅲ期11例，Ⅳa期3例。胸腺瘤合并 MG組患者除 MG外，不合并其他自身免疫性疾病，胸腺瘤不合并MG組患者不合并任何自身免疫性疾病。兩組年齡、性別、胸腺瘤病理分型及臨床分期等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 血清sFas檢測(cè)：術(shù)晨空腹采集患者肘靜脈血4mL，無(wú)抗凝，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組血清sFas水平。

1.2.2 胸腺淋巴細(xì)胞Fas檢測(cè)：切除胸腺組織常規(guī)制作石蠟標(biāo)本切片以SP法免疫組織化學(xué)染色［3］，觀察兩組胸腺淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)狀況。胞膜或胞質(zhì)被染成棕黃色者為Fas表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。采集免疫組化圖像（400倍）輸入到顯微圖像分析儀，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定兩組病例胸腺淋巴細(xì)胞Fas染色程度積分灰度值，積分灰度值越大，提示Fas蛋白表達(dá)量越高。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Fas蛋白表達(dá)：取術(shù)中獲取新鮮胸腺組織，去筋膜和血污，剪碎過(guò)80目無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)，制成胸腺單細(xì)胞懸液，再經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出胸腺淋巴細(xì)胞，制成胸腺淋巴細(xì)胞懸液備用。取胸腺淋巴細(xì)胞懸液，以細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞，離心提取上清，電泳，應(yīng)用100bp梯度Markers作為相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）大小對(duì)照，確定目的條帶（Mr 45 000），剔除其他蛋白條帶，將目的條帶轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，ECL顯色，UVP凝膠成像，應(yīng)用凝膠成像儀，進(jìn)行成像分析，測(cè)定兩組目的條帶的灰度值，與內(nèi)參GAPDH（Mr 37000）的灰度值進(jìn)行比較，該比值作為每個(gè)標(biāo)本Fas蛋白相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量越大，提示Fas蛋白表達(dá)量越高。

1.2.4 RT-PCR 法檢測(cè) Fas mRNA 表達(dá)：采用Trizol試劑一步法提取胸腺淋巴細(xì)胞總RNA，按superscriptⅡTM試劑盒說(shuō)明以RNA為模板，Oligo5.0為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中Fas mRNA序列設(shè)計(jì)1-9外顯子的引物［4］，以cDNA第一鏈為模板行PCR擴(kuò)增（95℃1min，56.5℃1 min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)）。Fas上游引物5′－ATGCTGGGCATCTGGACCCT-3′，下游引物5′－CACTCTAGACCAAGCTTTGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1011bp，β-actin 上 游引 物 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下 游 引 物 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度472bp。Fas和β-actin兩個(gè)反應(yīng)體系的產(chǎn)物與 Marker再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，紫外線下成像。β-actin為根據(jù)Genbank提供的Fas mRNA序列而設(shè)計(jì)的mRNA內(nèi)參照序列，Marker為100bp梯度的序列標(biāo)記mRNA，兩者一起用于確定Fas mRNA目的條帶。應(yīng)用凝膠成像儀，進(jìn)行成像分析，測(cè)定兩組目的條帶的灰度值，與β-actin灰度值進(jìn)行比較，該比值作為每個(gè)標(biāo)本Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量越大，提示Fas mRNA表達(dá)量越高。

1.2.5 Fas基因測(cè)序分析：隨機(jī)選取兩組胸腺淋巴細(xì)胞懸液各20例，按試劑盒操作提取基因組DNA，測(cè)D（λ）260nm值。D（λ）260nm值為1相當(dāng)于50 μg／mL雙鏈DNA，據(jù)此計(jì)算所提取的DNA濃度，確定為配制反應(yīng)體系時(shí)加入量。根據(jù)GeneBank查找的Fas基因序列［4］，分別設(shè)計(jì)各個(gè)外顯子的引物，PCR擴(kuò)增（94℃3min，94℃30s，72℃2min，共30循環(huán)，之后72℃5min）。取擴(kuò)增后樣本15 μL，Marker 3μL，加入loading buffer 3μL，混勻，電泳，根據(jù)GeneBank中查到的Fas基因1-9外顯子分子量和100bp梯度Marker標(biāo)記確定外顯子目的條帶，作為PCR產(chǎn)物原液，送TIANGEN公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)chomas145-95軟件分析，有差異者須再經(jīng)過(guò)3次雙向測(cè)序證實(shí)為異常堿基而非隨機(jī)誤差。將測(cè)得序列再與GENEBANK上的Fas基因外顯子序列進(jìn)行對(duì)比并結(jié)合單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行氨基酸變異情況分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件分析。兩組所測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清sFas水平 胸腺瘤合并MG組，血清sFas水平為（3879.06±706.51）pg／mL，明顯高于胸腺瘤不合并 MG組（1868.18±391.46）pg／mL（t＝63.19，P＜0.05）。

2.2 胸腺淋巴細(xì)胞Fas表達(dá) 胸腺瘤合并 MG組胸腺組織內(nèi)淋巴細(xì)胞Fas蛋白染色程度與上皮細(xì)胞相比明顯減弱（圖1A），胸腺瘤不合并MG組胸腺組織內(nèi)兩種細(xì)胞Fas蛋白染色程度基本相同（圖1B）。胸腺瘤合并MG組淋巴細(xì)胞染色積分灰度值（9.16±3.13）高于胸腺瘤不合并 MG 組（36.56±5.83）（t＝14.539，P＜0.05）。

2.3 胸腺淋巴細(xì)胞Fas蛋白表達(dá) 胸腺瘤合并MG組Fas蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.47±0.35，明顯低于胸腺瘤不合并 MG 組（3.67±0.55）（t＝18.58，P＜0.001）（圖2）。

2.4 胸腺淋巴細(xì)胞Fas mRNA表達(dá) 胸腺瘤合并 MG組Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.39±0.34，明顯低于胸腺瘤不合并 MG組（2.49±0.32）（t＝13.10，P＜0.001）（圖3）。

圖1 兩組患者胸腺Fas表達(dá)（SP法×400）

圖 2 兩組胸腺瘤患者胸腺淋巴細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)差異（Mr 45 000，Western blot）

圖 3 兩組胸腺淋巴細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)（RT-PCR）

圖 4 Fas基因第3、6、7號(hào)外顯子測(cè)序截圖（圖中箭頭所示為突變的位點(diǎn)）

2.5 Fas基因測(cè)序 兩組患者胸腺淋巴細(xì)胞均檢測(cè)到Fas基因第3、6、7外顯子堿基置換突變發(fā)生（圖4）。其中3號(hào)和7號(hào)外顯子各有一個(gè)突變位點(diǎn)，分別為G→A和T→C堿基置換突變，但不改變編碼氨基酸的類型，兩組發(fā)生概率基本相同。6號(hào)外顯子共發(fā)現(xiàn)有5個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)位點(diǎn)（7、20、60位點(diǎn)）分別為G→A、T→G和T→G突變，發(fā)生率兩組基本相同，在5%～15%之間；另兩個(gè)位點(diǎn)（16、21位）均為T→G突變，所編碼氨基酸分別發(fā)生 TTG（Leu，亮氨酸）→TGG（Trp，色氨酸）和TGG（Trp）→GGG（Gly，甘氨酸）改變，胸腺瘤合并MG組發(fā)生率分別為65%和75%，均高于胸腺瘤不合并 MG組的發(fā)生率（均為5%）（t＝15.12，P＜0.05）。

3 討論

MG患者機(jī)體存在體液和細(xì)胞免疫功能異常，多有胸腺增生或胸腺瘤等胸腺的病理改變［5］。約50%～70%的胸腺瘤患者合并不同程度MG。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，Masaoka臨床分期或WHO病理分型相同的胸腺瘤患者，有的合并不同分型的MG，有的卻不合并任何自身免疫性疾病，提示胸腺瘤分型和分期與MG無(wú)明確相關(guān)性，或相關(guān)性不明顯［6］。本研究中作者收集兩組不同病理分型和臨床分期的胸腺瘤患者，檢測(cè)并比較各自胸腺的病理改變，探討其胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)和免疫功能改變是否與MG發(fā)病有關(guān)。

胸腺是中樞免疫器官，前T淋巴細(xì)胞在此先分化形成CD4＋CD8＋雙陽(yáng)性細(xì)胞，再分別經(jīng)陽(yáng)性選擇、細(xì)胞凋亡和陰性選擇等，最終形成功能性淋巴細(xì)胞［7］，其中淋巴細(xì)胞凋亡對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境及免疫功能的穩(wěn)定，防止自身免疫性疾病的發(fā)生極具重要意義，而胸腺淋巴細(xì)胞陰性選擇與Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［8］。Fas屬于腫瘤壞死因子／神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族成員，分布于淋巴細(xì)胞表面，主要以膜分子（mFas）形式存在，少部分呈可溶性（sFas）形式。mFas是功能完整的跨膜糖蛋白，表達(dá)于淋巴細(xì)胞膜和胞質(zhì)，sFas是編碼mFas mRNA發(fā)生拼接變異時(shí)產(chǎn)生的少量缺乏跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)變異Fas［9］。人Fas基因包括9個(gè)外顯子，外顯子2-5編碼膜外端，外顯子6編碼跨膜區(qū)，外顯子7－9編碼膜內(nèi)端。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)Fas缺陷的突變鼠和人類易患淋巴細(xì)胞增生性疾?。↙Pr）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等自身免疫性疾病［10］，說(shuō)明異常的細(xì)胞凋亡在自身免疫性疾病發(fā)病中具有重要地位，淋巴細(xì)胞凋亡缺陷主要與Fas基因調(diào)控異常有關(guān)［11］，因此檢測(cè)胸腺淋巴細(xì)胞Fas的變異對(duì)于探討MG的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

血清中少許sFas主要為Fas mRNA以不同方式進(jìn)行剪接加工后的翻譯產(chǎn)物，明顯升高則多為Fas基因突變導(dǎo)致Fas mRNA表達(dá)異常。缺乏跨膜區(qū)的sFas易從自身反應(yīng)性T細(xì)胞膜上脫落，使其喪失部分與Fasl結(jié)合位點(diǎn)，未脫落的sFas又與淋巴細(xì)胞膜上的Fas（主要為mFas）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Fasl導(dǎo)致Fasl與自身反應(yīng)性T細(xì)胞mFas結(jié)合水平下降，下調(diào)自身反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡［12］。本研究結(jié)果顯示，在Fas蛋白表達(dá)上，胸腺瘤合并MG組患者胸腺淋巴細(xì)胞Fas明顯減少，表達(dá)明顯減弱，而血清中sFas水平明顯高于胸腺瘤不合并MG組，提示MG患者的胸腺淋巴細(xì)胞存在Fas mRNA表達(dá)異常和Fas基因異常，可能是誘發(fā)MG等自身免疫性疾病的原因。

本研究中對(duì)Fas基因進(jìn)行測(cè)序和突變檢測(cè)分析顯示，兩組患者胸腺淋巴細(xì)胞均有第3、6、7號(hào)外顯子堿基置換突變發(fā)生。其中3號(hào)外顯子和7號(hào)外顯子各有1個(gè)突變位點(diǎn)，但不改變所編碼氨基酸的類型，且兩組發(fā)生的概率基本相同，均在15%～25%之間。6號(hào)外顯子共發(fā)現(xiàn)有5個(gè)突變位點(diǎn)，且均會(huì)改變編碼氨基酸的類型。其中3個(gè)位點(diǎn)的突變發(fā)生率兩組基本相同，在5%～15%之間。另外2個(gè)位點(diǎn)（第16、21位）均為T→G堿基置換突變，所編碼氨基酸分別發(fā)生TTG（Leu）→TGG（Trp）和TGG（Trp）→GGG（Gly）改變，胸腺瘤合并 MG組發(fā)生率分別為65%和75%，明顯高于胸腺瘤不合并MG組（發(fā)生率均為5%）。由于6號(hào)外顯子編碼Fas蛋白跨膜區(qū)，其發(fā)生基因突變可能會(huì)造成Fas蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)變異或消失，機(jī)體出現(xiàn)淋巴細(xì)胞表面mFas減少，血清中缺乏跨膜區(qū)的sFas增多現(xiàn)象，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互對(duì)應(yīng)。因此，可以推測(cè)，MG發(fā)生的根本原因可能是胸腺淋巴細(xì)胞Fas基因突變，尤其是外顯子6的某些位點(diǎn)突變而導(dǎo)致的Fas蛋白跨膜區(qū)的缺陷，MG只是Fas基因突變引起的自身免疫性疾病之一，與近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符［13］。同時(shí)也可以對(duì)有些胸腺瘤合并MG患者同時(shí)還伴有甲亢、單純紅細(xì)胞貧血、扁平苔蘚及SLE等多種自身免疫性疾病以及有些患者在切除胸腺瘤數(shù)年后還可出現(xiàn)MG等現(xiàn)象進(jìn)行解釋。

胸腺瘤和全胸腺擴(kuò)大切除是目前治療MG的首選方法，有一定療效，但并不理想，尤其是全身型MG，病史較長(zhǎng)者，術(shù)后仍需長(zhǎng)期服藥，癥狀時(shí)有反復(fù)，其主要原因是血清及胸腺以外的淋巴器官內(nèi)仍有釋放抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的淋巴細(xì)胞沒(méi)有被清除，MG治療仍是一個(gè)臨床難題。如能在基因水平誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，以抑制抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的產(chǎn)生，有可能為MG的治療提供有效的對(duì)因治療方法。

綜上所述，MG可能是一種包括Fas等自身基因控制的自身免疫性疾病，在基因水平誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，以抑制抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的產(chǎn)生，有可能為MG的治療提供有效的對(duì)因治療方法，有必要在今后的研究工作中進(jìn)行探索。

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