林興盛 石松菁 戴木森

山莨菪堿對百草枯中毒大鼠肺、肝損害及血漿TNF-α變化的影響

林興盛 石松菁 戴木森

目的 探討山莨菪堿對PQ中毒的治療作用。方法 將SD大鼠分成治療組(A組)、單純?nèi)径窘M(B組)、對照組(C組)三組, A、B兩組大鼠腹腔內(nèi)注射PQ 20 mg/kg體重染毒, C組注射生理鹽水對照。A組大鼠于染毒后2 h始, 按30 mg/kg體重用量3次/d腹腔內(nèi)注射山莨菪堿治療；B組大鼠于相應(yīng)時點3次/d腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水對照。檢測A、B兩組大鼠染毒后第3天、5天、7天PaO2、血TNF-a、血GPT水平, 并與C組對照。留取染毒7 d后A、B兩組動物肝、肺標本進行病理學(xué)觀察。結(jié)果 A、B兩組大鼠血TNF-α濃度明顯較C組高, 但A組大鼠血TNF-α升高幅度較B組低, 與B組對比三個時點均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)；A組PaO2、ALT也有一定程度改善。A組大鼠PaO2于染毒后7 d, ALT于染毒后5 d、7 d, 和B組大鼠相應(yīng)時點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。染毒后7 d, 和B組比較, A組大鼠肝、肺病理改變相對輕微。結(jié)論 山莨菪堿對PQ中毒大鼠肺、肝損傷有一定的治療作用, 這可能與其抑制TNF-α的產(chǎn)生、改善微循環(huán)等作用有關(guān)。

百草枯；中毒；山莨菪堿；大鼠；肺；肝；病理改變

百草枯(PQ)是我國常用除草劑, PQ中毒后死亡率高達60%~80%。PQ主要通過自由基產(chǎn)生毒性。研究表明, PQ中毒導(dǎo)致的多器官功能損害和肺纖維化過程中, 尚有大量細胞因子的參與。山莨菪堿能抑制和減少許多重要細胞因子的產(chǎn)生, 對MODS中的急性肺損傷、肝損害等均有治療作用。本文對PQ中毒大鼠用山莨菪堿進行干預(yù), 探討其對PQ中毒大鼠血TNF-α濃度變化的影響及對肺、肝功能損害的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 20%百草枯溶液為(江蘇省)先正達南通作物保護有限公司產(chǎn)品。TNF-αELISA試劑盒, 購自深圳晶美生物工程有限公司；全自動生化分析儀, 型號為(美國)Bakaman LX20；酶標儀(450 nm), 型號為(英國)Wellscan MK2。

1.2 動物分組與模型制備 健康雄性清潔級SD大鼠, 12周齡左右, 共56只。隨機分成A、B、C三組, A組為山莨菪堿治療組, 共24只；B組為單純PQ染毒組, 共24只；C組為對照組, 共8只。A、B兩組各又再分為3個亞組(即：A1、A2、A3組和B1、B2、B3組), 每亞組為8只大鼠。

將20%PQ原液用無菌生理鹽水配成5 mg/ml的PQ稀釋液, A、B組大鼠腹腔內(nèi)注射PQ稀釋夜一次性染毒, 染毒量為PQ20 mg/kg體重。A組大鼠于染毒后2 h始, 按30 mg/kg體重量3次/d腹腔內(nèi)注射山莨菪堿治療；B組大鼠3次/d腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水對照。

1.3 標本采集A1、B1組大鼠于染毒后3 d左心腔穿刺抽血留取血標本, 檢測血TNF-a、血氧分壓(PaO2)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT), 采血后處死動物。用同樣方法, A2、B2組動物于染毒后5 d留取血標本, A3、B3組于染毒后7 d留取血標本, 檢測結(jié)果與對照組對照。A3、B3組動物處死后, 盡快剪下左肝、左下肺, 置入10%福爾馬林液固定, 留作病理學(xué)檢查。

1.4 嚴格按照試劑盒說明書, 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿TNF-α；病理學(xué)檢查在病理科老師的指導(dǎo)下進行,常規(guī)標本石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色；PaO2、GPT檢測均由相應(yīng)儀器自動完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包完成, 數(shù)值以均數(shù)±標準差( x-±s)表示。A、B兩組大鼠各亞組PaO2及血漿TNF-α、ALT水平與C組比較采用單因素方差分析；相同時點A、B兩組的參數(shù)比較采用成組t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義, P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQ染毒后, A、B兩組大鼠血漿TNF-α、ALT濃度在染毒后第3、5、7天均明顯升高, 而PaO2明顯降低, 和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 B組大鼠血漿TNF-α升高的幅度明顯較A組高, 和A組相應(yīng)時點對比, 染毒后第3、5、7天三個時點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。A組大鼠PaO2也有一定程度改善, 于染毒后第7天改善較明顯, 和B組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 但染毒后第3、5天兩個時點兩組對比未達統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組大鼠于染毒后第5、7天ALT也有較大改善,和B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 但染毒后第3天和B組對比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 A、B兩組同一時點血漿TNF-α、PaO2、ALT的比較(x-±s)

2.3 PQ染毒后7 d, B組大鼠肺間質(zhì)膠原沉積, 成纖維細胞過度增殖, 毛細血管充血, 巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤, A組同樣存在上述病理改變, 但較B組輕微。

2.4 PQ染毒后7天, B組大鼠肝細胞增生, 出現(xiàn)點狀肝細胞壞死, 細胞質(zhì)空泡變性, 細胞核出現(xiàn)固縮變性, 肝匯管區(qū)膠原沉積、成纖維細胞增殖, 肝竇內(nèi)枯否細胞增多。A組大鼠肝細胞細胞質(zhì)、細胞核變性明顯減輕, 沒有發(fā)現(xiàn)點狀肝細胞壞死。

3 討論

PQ不僅通過自由基及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)直接引起體內(nèi)重要組織特別是肺組織的破壞, 而且還通過各種細胞因子和炎性介質(zhì)進一步加重組織損害。作者前期研究表明, PQ中毒4 h,大鼠肺、肝NF-кBP65、MCP-1mRNA表達就已明顯上調(diào)［1］,表明百草枯中毒早期, 就有大量細胞因子的參與。本文研究表明, PQ中毒大鼠血TNF-α明顯升高, 這和作者前期研究結(jié)果PQ中毒4 h大鼠肺、肝NF-кBP65、MCP-1mRNA表達明顯上調(diào)是一致的, 進一步證實細胞因子參與了百草枯的中毒作用。

用腹腔內(nèi)注射20 mg/kg體重PQ染毒, 7 d后大鼠肺、肝病理檢查發(fā)現(xiàn), 大鼠肺間質(zhì)膠原沉積, 成纖維細胞過度增殖, 毛細血管充血, 巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤；大鼠肝細胞增生, 出現(xiàn)點狀肝細胞壞死, 細胞質(zhì)空泡變性,細胞核出現(xiàn)固縮變性, 肝匯管區(qū)膠原沉積、成纖維細胞增殖,肝竇內(nèi)枯否細胞增多。表明大劑量百草枯染毒大鼠, 不但其肺、肝出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤及成纖維細胞增殖, 甚至細胞壞死, 而且還可直接損害毛細血管導(dǎo)致微循環(huán)障礙, 這可能是大劑量百草枯中毒患者早期致多器官功能衰竭的主要原因。

山莨菪堿是膽堿能受體拮抗劑, 研究表明, 山莨菪堿具有抑制TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生和對抗自由基作用, 對ARDS有一定的治療作用［2-5］, 山莨菪堿還具有擴張血管、保護血管內(nèi)皮細胞等多種作用, 因此被廣泛用于治療膿毒性休克, 療效肯定。作者用山莨菪堿給予干預(yù)治療后, 和單純PQ中毒組相比, 山莨菪堿治療組大鼠PaO2、ALT存在一定程度的改善, 肺、肝病理改變也較單純PQ中毒組輕, 表明山莨菪堿對PQ中毒大鼠有一定的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn), PQ中毒大鼠經(jīng)山莨菪堿治療后, 其血漿TNF-α濃度升高明顯受到抑制, 表明山莨菪堿可以抑制百草枯中毒大鼠血TNF-α的產(chǎn)生。大劑量PQ中毒同膿毒性休克一樣, 同樣還存在微循環(huán)障礙和自由基損傷。因此可以推測, 山莨菪堿對PQ中毒大鼠肺、肝損傷有一定的治療作用, 可能與其具有抑制TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生、對抗自由基和擴張血管、保護血管內(nèi)皮細胞等作用有關(guān)。

［1］ 林興盛,石松菁,戴木森.早期百草枯中毒大鼠肺和肝組織NF-кBP65、MCP-1 mRNA表達的變化.福建醫(yī)藥雜志, 2010, 32(1): 87-89.

［2］ 朱運奎,張世范.山莨菪堿對高原內(nèi)毒素致急性肺損傷的防治作用實驗研究.中國危重病急救醫(yī)學(xué), 1995,7(5):261-264.

［3］ 尹文,梁繼河,蔡春,等.山莨菪堿對急性肺損傷腫瘤壞死因子-α的影響及意義.中國急救醫(yī)學(xué), 2000,20(1):8-9.

［4］ 梁繼河,朱云喜,李琦.山莨菪鹼對創(chuàng)傷性肺損傷防治作用的實驗研究.中華創(chuàng)傷雜志, 1998,14(5):284-287.

［5］ 劉鳳,于小玲,石增立,等.IL-8、TNF-α在大鼠敗血癥形成過程中的變化及山莨菪堿的影響.中國病理生理雜志, 1998, 14(6): 587-691.

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