徐亞東 劉俊英 徐亞光 鹿愛平 任媛媛 王春蘭

肺癌的發(fā)生與正常細胞中的原癌基因和抑癌基因有關(guān)。兩者之間平衡失調(diào)對腫瘤發(fā)生起決定作用。中藥的抗瘤機制是目前廣大學者研究的熱點。多數(shù)研究報道丹參據(jù)有抗腫瘤的作用［1］，但丹參注射液對lewis肺癌的抗腫瘤的機制尚在探討中。p53、p16是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切且相關(guān)報道較多的兩種基因。本實驗研究丹參注射對小鼠Lewis肺癌組織p53、p16表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑 藥物:丹參注射液(DS，正大青春寶藥業(yè)有限公司，每支10 ml，相當于原生藥15 g，批號0101156)。注射用環(huán)磷酰胺(CTX江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，每支200 mg，批號06052021國藥準字H32020857)。兔抗人COX-2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法 ①動物:C57BL/6純系小鼠，雄性6～8周，20±2 g，60只，北京維通利華公司動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(京)2002-2003。在SPF級實驗動物房內(nèi)養(yǎng)殖。②瘤株:Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供并傳代保種;動物許可證號:SCXK(京)2004～0001，Lewis肺癌維持在C57 BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。③動物分組:取C57 BL/6小鼠60只，隨機分為3組:鹽水空白對照組、丹參組、環(huán)磷酰胺組，每組20只。各組間小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義。④荷瘤動物模型的建立:取傳代后14 d的Lewis肺癌瘤源小鼠，頸脫臼處死，固定于鼠板上，常規(guī)消毒，于超凈工作臺中，從腋部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，剔除纖維包膜和壞死組織，在無菌平皿中剪碎，置組織研磨器中加4℃生理鹽水，輕輕研磨過濾，制成瘤細胞懸液，0.4%臺盼藍計數(shù)，細胞活力大于95%調(diào)整細胞為1×107/ml。以上述瘤細胞懸液0.2 ml于右腋部皮下注射，以建立模型。⑤給藥方法:從接種腫瘤次日開始，鹽水組日腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 ml，連續(xù)10 d;丹參組予丹參注射液20 mg/(kg·d)連續(xù)給藥10 d;環(huán)磷酰胺組隔日一次給予環(huán)磷酰胺250 mg/(kg·d)共5次。

1.3 測定方法 給藥10天后，次日脫頸椎處死小鼠，將腫瘤組織常規(guī)病理取材，SP法免疫組化，結(jié)果由2位病理學專家分別觀察作出判斷。

1.4 結(jié)果判定 P53陽性呈棕黃色顆粒，主要在腫瘤細胞核內(nèi)表達。P16以細胞漿和(或)細胞核染色呈棕黃色顆粒為陽性。結(jié)果采用半定量積分法:即根據(jù)每張切片的陽性細胞比及著色深淺積分，著色細胞比例占1/3為1分，占1/3～2/3為2分，占2/3以上為3分;著色程度，無著色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。然后根據(jù)二者乘積判斷陽性等級，0分為陰性，1～2分(+)，3～4分(++)，4分以上(+++)，以此計算陽性表達率。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

p53陽性細胞在生理鹽水組數(shù)量較多，陽性信號表達強，呈棕褐色;丹參組陽性細胞數(shù)較少，呈棕黃色;CTX組陽性細胞數(shù)最少，陽性信號表達較弱，呈淺黃色。經(jīng)統(tǒng)計學處理，生理鹽水組LewiS肺癌細胞p53陽性率明顯高于丹參組及化療組(P＜0.01)。p16陽性細胞在生理鹽水組數(shù)量較少，陽性信號表達弱，呈淺黃色;丹參組細胞數(shù)較多，呈棕黃色;CTX組陽性細胞數(shù)最多，呈棕褐色。經(jīng)統(tǒng)計學處理，生理鹽水組LewiS肺癌細胞p16陽性率明顯低于丹參組及化療組(P＜0.01)。

表1 丹參注射液對小鼠Lewis肺癌P53、P16表達的影響

3 討論

p53基因是DNA損傷的傳感器，抑制細胞周期的介體和細胞凋亡的誘發(fā)因子。它分突變型和野生型，突變型p53基因是癌基因，在細胞轉(zhuǎn)化中起作用，野生型p53基因是抑癌基因(野生型P53蛋白的半衰期短，一般不能用免疫組化的方法檢測)。突變型p53基因則喪失了抑癌功能，促進細胞轉(zhuǎn)化與過度增殖導致腫瘤形成［2］。

p16基因抑制腫瘤的機制主要是:p16蛋白產(chǎn)物與細胞周期蛋白D競爭CDK4/6的結(jié)合，當p16與CDK4/6結(jié)合后，cyclinD-CDK4/6復(fù)合物活性受到抑制，細胞分裂生長受阻。cyclinD-CDK4/6復(fù)合物對pRB蛋白具有磷酸化作用，pRB被磷酸化后，其G1期停滯作用喪失，而pRB非磷酸化時，可阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增生。p16通過抑制CDK4/6激酶的功能而使pRB不能磷酸化，使未磷酸化pRB增多而抑制細胞增生［3］。

我們現(xiàn)在進行了丹參注射液對小鼠Lewis肺癌p53、p16表達影響的實驗研究，結(jié)果表明:小鼠Lewsi肺癌細胞p53的表達在丹參注射液組的陽性率明顯低于生理鹽水組(P＜0.01)。p16的表達在丹參注射液組的陽性率明顯高于生理鹽水組(P＜0.01)。說明丹參注射液能抑制腫瘤細胞p53的表達，增強p16的表達。

［1］ 梁華，姜玉華，褚磊，等．丹參注射液對lewis肺癌小鼠移植瘤生長轉(zhuǎn)移及 VEGF表達的影響．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，16(2):177-181．

［2］ 柳德靈，林慶安，余英豪，等．肺癌組織中P53和Ki-67的表達及意義．國際呼吸雜志，2012，32(16):1256-1258．

［3］ 孫佳，姜秀峰，惠富新．P16基因育肺癌關(guān)系研究進展．國際腫瘤學雜志，2010，37(11):852-855．