魏 凱 張 丹 竇傳字 馬曉芃 楊 玲 吳煥淦 洪 玨 朱 毅 張翠紅劉 婕 吳凌翔 黃 燕

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203;2上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030)

克羅恩病(Crohn's Disease，CD)為炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)的一種，是一種病因不明的慢性非特異性肉芽腫性炎癥性腸病［1－2］。該病多為慢性起病，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。在歐美等發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，在我國的發(fā)病率近年來有升高趨勢(shì)［3－4］，預(yù)計(jì)今后可能會(huì)持續(xù)增高，應(yīng)當(dāng)予以高度重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗菌藥物及手術(shù)治療，但藥物不良反應(yīng)和手術(shù)復(fù)發(fā)率高是當(dāng)今難點(diǎn)［5］。針灸治療CD具有一定的優(yōu)勢(shì)，臨床研究顯示針灸療法治療輕中型CD具有確切療效［6－7］，能顯著改善CD患者的全身癥狀，減少腹瀉次數(shù)，降低CD活動(dòng)指數(shù)［8］，且安全無不良反應(yīng)，值得進(jìn)一步應(yīng)用和深入研究。

免疫功能異常是CD的主要發(fā)病原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB的高表達(dá)在CD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，在CD患者結(jié)腸組織中NF－κB的表達(dá)顯著增高［9－10］。細(xì)胞內(nèi)激活的NF－κB發(fā)生核移位后可與核內(nèi)的靶基因結(jié)合，引起多種促炎基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)炎癥因子(TNF － α、IL －1β)等的表達(dá)［11］。因此，本研究建立CD大鼠模型，觀察隔藥灸對(duì)CD大鼠結(jié)腸NF－κB p65及炎癥因子TNF－α、IL－1β表達(dá)的影響，為艾灸治療CD療效機(jī)制的闡明提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體重(150±10)g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):SCXK(滬)2009－0019)。飼養(yǎng)條件:清潔級(jí)，室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度50% ～70%，自由攝取飲水、食物。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，觀察大鼠飲食、活動(dòng)正常后開始實(shí)驗(yàn)。SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組和隔藥灸組，每組15只。

1.2 主要儀器與試劑 組織脫水機(jī)(德國萊卡公司)、包埋機(jī)(德國萊卡公司)、切片機(jī)(德國萊卡公司);5%(w/v)2，4，6 － 三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司);兔抗大鼠TNF－α一抗(武漢博士德公司)，IL－1β一抗(Santa Cruz、Envison/HRP)，NF － κB p65(A)一抗(Santa Cruz、Envison/HRP);美沙拉秦腸溶片(德國Losan Pharma GmbH)。

1.3 模型制備 模型制備參照國際公認(rèn)的Morris法［12］，應(yīng)用TNBS合乙醇溶液造模。造模開始前禁食、不禁水24 h，稱重后以生理鹽水配制的1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行腹腔注射麻醉。將無水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將5%(W/V)的TNBS與50%乙醇按照體積比2∶1混合成TNBS灌腸液，造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL/kg(TNBS用量為100 mg/kg)灌腸。灌腸針連接注射器，并抽取適當(dāng)灌腸液，大鼠體位為頭下尾上，灌腸時(shí)將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6～8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針以后再將大鼠倒立1 min，以防藥液溢出。每7 d重復(fù)灌腸1次，共4次。造模結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取1只大鼠，取其結(jié)腸做HE染色以確定模型制備是否成功。

1.4 分組與治療 隔藥灸組:取穴為天樞(雙)、氣海。采用隔藥餅灸，藥餅配方為附子、肉桂、丹參等藥研末，灸前用黃酒調(diào)和并用自制動(dòng)物專用模具制成藥餅。艾炷選精制艾絨約90 mg，制成小椎體狀，每次每穴各灸2壯，每日隔藥餅灸1次，共灸7次。

西藥組:采用美沙拉秦灌胃治療。將美沙拉秦腸溶片研末，用雙蒸水配制成灌胃液，每日投藥量按成人(70 kg體重，4 g/d)與大鼠(200 g體重)56∶1的比例［13］，每日1 次，共灌胃7 次。

模型組與正常組不進(jìn)行任何治療，只作與隔藥灸組相同的抓取與固定。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.5.2 結(jié)腸組織 NF－κB p65及TNF－α、IL－1β表達(dá)的測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)，并進(jìn)行圖像分析。主要包括以下步驟。1)結(jié)腸組織石蠟塊4 μm常規(guī)切片，于推片機(jī)水面上展片、撈片之后置烤片機(jī)上60℃烤片2～3 h。2)常規(guī)脫蠟水化:將石蠟切片浸于二甲苯中5 min×3次，無水乙醇3 min×2次，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3 min，之后PBS沖洗3 min×3次。3)抗原修復(fù):切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐內(nèi)以中高火加熱至沸騰，室溫下放置5 min后再加熱至沸騰1次，然后室溫下自然冷卻，之后切片用PBS沖洗3 min×3次。4)消除內(nèi)源性過氧化物酶:滴加以PBS稀釋的3%過氧化氫(H2O2)于組織上，避光孵育20 min。用PBS沖洗3 min×3次。5)滴加一抗:滴加50 μL適當(dāng)濃度的一抗于組織上，4℃冰箱過夜。之后于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)溫45 min，PBS沖洗5 min×3次。6)滴加二抗:滴加1滴二抗工作液于組織上，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。7)DAB顯色:滴加50μLDAB工作液于組織上，室溫孵育，光鏡下控制顯色時(shí)間。顯色完全后，用雙蒸水沖洗終止顯色。8)復(fù)染:切片置蘇木素內(nèi)染色2.5 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化5 s，之后再流水沖洗10 min返藍(lán)。9)脫水、透明、封片:切片置70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇中各3 min，二甲苯5 min×2次，中性樹膠封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察。10)數(shù)據(jù)采集:在固定光亮度下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝照片，通過Image－Plus Pro 6.0軟件分析并獲取每張照片的陽性目標(biāo)積分光密度，取平均值即為該切片的陽性目標(biāo)積分光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的資料采用(s)的形式表示;不符合正態(tài)分布的資料采用Median(min～max)的形式表示。若各組方差齊等，直接采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)一步采用LSD檢驗(yàn)做兩兩比較;若各組方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)一步采用Nemenyi法進(jìn)行兩兩比較。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 光鏡下觀察，正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮連續(xù)覆蓋，表面可見紋狀緣，黏膜固有層單層杯狀細(xì)胞、腺腔排列整齊，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，可見成纖維細(xì)胞、膠原纖維、血管、脂肪細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞，未見水腫或增生，腸壁肌層、漿膜層分布清晰。模型組腸道炎癥明顯，黏膜表面潰瘍形成，局部黏膜上皮層缺失，裂隙狀潰瘍形成，固有層間質(zhì)、黏膜下層結(jié)締組織明顯水腫伴大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層可見成團(tuán)單核巨噬細(xì)胞聚集，偶見結(jié)節(jié)病樣肉芽腫形成，伴有大量纖維組織增生，局部黏膜固有層杯狀細(xì)胞增生明顯，腺腔排列紊亂，腸壁肌層、漿膜層分布尚清晰，提示克羅恩病模型制備成功。西藥組可見愈合性潰瘍形成，結(jié)腸黏膜腺體排列較整齊，黏膜層可見炎性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層有水腫、增厚及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸壁黏膜下層、肌層及漿膜層分布清晰。隔藥灸組可見愈合性潰瘍，輕度充血水腫，黏膜上皮覆蓋完整，黏膜固有層明顯增厚，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量杯狀細(xì)胞增生，單層杯狀細(xì)胞、腺腔排列尚整齊，黏膜下層結(jié)締組織輕度水腫，可見脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少量膠原纖維及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腸壁肌層、漿膜層分布清晰。提示，隔藥灸組和西藥組對(duì)CD大鼠腸道炎癥、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)具有一定的改善作用。

2.2 結(jié)腸組織NF－κB p65免疫組化染色結(jié)果 由圖1可見，NF－κB p65在正常組僅少量表達(dá)于結(jié)腸黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi);在模型組的表達(dá)顯著高于正常組，多表達(dá)于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi);西藥組和隔藥灸組表達(dá)均接近正常組，少量表達(dá)于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)。圖像分析的結(jié)果顯示，模型組NF－κB p65的表達(dá)較正常組顯著增高(P＜0.01)，隔藥灸與西藥治療后，均能顯著降低CD模型大鼠結(jié)腸組織NF－κB p65的表達(dá)(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色結(jié)果

表1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色積分光密度(s)

表1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色積分光密度(s)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01。

10 620.37±434.30模型組 10 4322.09±2740.90＊＊西藥組 10 674.03±209.86△△隔藥灸組 10 744.20±272.53 B p65正常組組別 鼠數(shù) NF－κ△△

圖2 各組大鼠結(jié)腸TNF－α免疫組化染色結(jié)果

2.3 結(jié)腸組織TNF－α、IL－1β免疫組化染色結(jié)果由圖2可見，TNF－α在正常組僅微弱表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì);在模型組強(qiáng)表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞和黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi);西藥組TNF－α表達(dá)較弱，接近正常組;隔藥灸組TNF－α表達(dá)較模型組明顯減弱，表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞和黏膜間質(zhì)淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。由圖3可見:正常組IL－1β僅微弱表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)，少量表達(dá)于黏膜間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì);模型組IL－1β表達(dá)較正常組顯著增強(qiáng)，主要表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì);西藥組和隔藥灸組IL－1β較模型組顯著降低，僅少量表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)淋巴、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)。圖像分析結(jié)果顯示:模型組TNF－α、IL－1β的表達(dá)較正常組均顯著增高(P＜0.01)，西藥與隔藥灸治療均能降低CD模型大鼠結(jié)腸組織 TNF－α(P＜0.01)、IL－1β(P＜0.05，P ＜0.01)的表達(dá)。

圖3 各組大鼠結(jié)腸IL－1β免疫組化染色結(jié)果

表2 各組大鼠結(jié)腸TNF－α、IL－1β免疫組化染色積分光密度

表3 TNF－α、IL－1β與NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性Median(min～max)

2.4 結(jié)腸TNF－α、IL－1β與NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性分析 由表3、圖4－5可知:大鼠結(jié)腸組織炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達(dá)與NF－κB p65的表達(dá)均呈正相關(guān)性。

圖4 TNF－α與NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性

圖5 IL－1β與NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并無克羅恩病的專屬名詞，根據(jù)其病因病機(jī)及其臨床癥狀可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)的腸癖、久痢、便血、滯下、腹痛等范疇。本課題組自2000年開始，從臨床與實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面較為深入地開展了針灸治療克羅恩病的專項(xiàng)研究。采用天樞、氣海為主穴隔藥灸治療輕、中型CD，近期有效率達(dá)72.7%［14］;在臨床有效的基礎(chǔ)上，開展了一系列的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，采用三硝基苯磺酸(TNBS)制備實(shí)驗(yàn)性CD大鼠模型［15］，探討針灸治療CD的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示針灸能顯著改善CD模型大鼠腸組織病理損傷，降低血清TNF－α，降低腸黏膜異常增高的TNF－α、TNFR1、TNFR2，下調(diào)結(jié)腸TGF － β、FGF、CTGF、IGF －I、IGF －IR、IGFBP －5 的異常表達(dá)，從而減輕CD腸道炎癥，改善組織損傷和腸纖維化，發(fā)揮治療作用［6，16－20］。上述研究顯示針灸對(duì) CD具有良好的干預(yù)作用，值得進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用。

NF－κB/Rel家族共有5個(gè)成員，分別是 RelA/p65，c－ Rel，RelB，NF － κB1(p105/p50)和 NF － κB2(p100/p52)［11，21］。NF － κB/Rel多以 5 個(gè)亞單位組成的同質(zhì)或異質(zhì)二聚體的形式存在，其中p50/p65異質(zhì)二聚體(即NF－κB)最為常見。p50亞單位介導(dǎo)NF－κB與DNA上的κB序列的結(jié)合，p65亞單位可以利用其C端反式激活域增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，并介導(dǎo)IκB的激活。在未受刺激的細(xì)胞內(nèi)，NF－κB的異質(zhì)二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合形成三聚體，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)內(nèi)。外界刺激信號(hào)可通過一系列反應(yīng)磷酸化并降解IκB，從而暴露NF－κB的核定位序列(NLS)，并使其激活。激活的NF－κB發(fā)生核移位，通過p50亞單位的NLS與核內(nèi)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)促炎基因的轉(zhuǎn)錄，在免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［22］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NF－κB在IBD(CD和UC)的發(fā)病和進(jìn)展中起著尤為重要的作用［23］。在IBD患者腸道黏膜巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞中有大量被激活的 NF－κB［24］，可以調(diào)節(jié)與IBD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子(TNF－α、IL－1β、IL－6等)的產(chǎn)生和釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)。NF－κB p65亞單位在CD和UC患者腸黏膜組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且在 CD 患者中尤為明顯［25－26］，免疫組織化學(xué)染色表明CD中活化的NF－KB主要定位于黏膜固有層單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)，但黏膜下表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中亦可見陽性染色。NF－κB mRNA在脾虛型CD大鼠的表達(dá)也顯著升高［27］。NF－κB p65 siRNA對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型有保護(hù)效應(yīng)，利用NF－κB p65 siRNA靶向阻斷NF－κB途徑可能成為IBD基因治療的新方法［28］。以上研究結(jié)果均提示，NF－κB與CD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有效抑制NF－κB的表達(dá)，能夠降低炎性因子的分泌，改善組織損傷。

TNF－α、IL－1β均為重要的促炎因子。TNF－α主要由活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在CD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，不但可以引起炎癥細(xì)胞在腸道的聚集，增加結(jié)腸上皮細(xì)胞的滲透性，引發(fā)炎癥、水腫和肉芽腫形成，還可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡［29－30］。IL－1β 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮介質(zhì)作用，具有多種生物學(xué)功能，它不僅能促使中性粒細(xì)胞活化、巨噬細(xì)胞脫顆粒以及炎癥因子的釋放，還能增加上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，引起一系列腸道炎癥反應(yīng)和組織破壞［31－32］。在IBD的發(fā)病中，NF－κB靶基因的表達(dá)失調(diào)，會(huì)引起TNF－α、IL－1β 等炎癥因子的高表達(dá)［4］。高表達(dá)的炎癥因子又可作為NF－κB信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，進(jìn)一步促進(jìn)該通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)更多NF－κB的激活，對(duì)該通路起正向放大作用，加重炎癥反應(yīng)。以上研究提示，NF－κB與TNF－α、IL－1β均為CD發(fā)病中的關(guān)鍵因子，因此本文觀察艾灸對(duì)NF－κB p65與TNF－α、IL－1β的調(diào)節(jié)作用以進(jìn)一步闡釋艾灸治療克羅恩病的免疫機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，CD模型大鼠結(jié)腸組織NF－κB p65的表達(dá)顯著增高，且多表達(dá)于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)，隔藥灸治療后，CD大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)顯著改善，腸道炎癥減輕，NF－κB p65的表達(dá)亦顯著降低，提示NF－κB p65與CD發(fā)病密切相關(guān)，降低NF－κB p65的表達(dá)是隔藥灸治療CD的重要機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)，隔藥灸能顯著降低CD模型大鼠結(jié)腸組織中顯著增高的炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達(dá);TNF－α、IL－1β均為 NF－κB p65的下游炎癥因子，進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1β的表達(dá)與NF－κB p65的表達(dá)呈正相關(guān)，提示抑制CD大鼠結(jié)腸NF－κB p65的表達(dá)，進(jìn)而減少其下游炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達(dá)，從而減輕腸道炎癥，改善結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，可能是艾灸(隔藥灸)治療CD的重要效應(yīng)機(jī)制。NF－κB的激活涉及IκB的磷酸化，而后者有賴于 IKK(IκB 激酶)的調(diào)控，IKK/IκB/NF － κB 是一個(gè)有機(jī)聯(lián)系的系統(tǒng)，繼續(xù)深入研究CD IKK/IκB/NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑和艾灸對(duì)其調(diào)節(jié)作用，有助于進(jìn)一步闡明艾灸治療CD的效應(yīng)機(jī)制。

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