馬利平，郝變青，王 靜，喬雄梧

（山西省農業(yè)科學院農產品質量安全與檢測研究所，山西省農藥重點實驗室，山西太原030031）

辣椒（甜椒、辣椒）是人們日常生活不可或缺的蔬菜，種植辣椒是各地菜農的主要致富門路之一。辣椒種植面積的不斷擴大，使得各地一年四季辣椒供應源源不斷。但在辣椒生產中與其如影隨形的土傳病害如辣椒疫病、辣椒枯萎病及各種葉斑病始終是困擾菜農的棘手問題。據2012年山西、河北上百個縣鄉(xiāng)田間調查發(fā)現，在連作多年的重茬地、自留種地、低洼下濕地，辣椒病害發(fā)病率一般在30%以上，遇雨水頻繁年份，植株死亡率多在60%～70%之間。辣椒疫病菌主要以卵孢子、厚垣孢子在病殘體或土壤及種子上越冬，其中，土壤和病殘體上帶菌率高，是主要的初侵染源。辣椒枯萎病菌主要以厚垣孢子在土壤中越冬，或進行較長時間的腐生生活，主要通過灌溉水在田間傳播，也可隨病土借風傳播。辣椒黑斑病菌雖多侵染葉片和果實，但土壤中和病殘體上是其主要越冬場所[1-4]。這幾種病害隨辣椒種植年限延長和管理不善會逐年加重，而土傳病害的防治藥劑屈指可數。近年來，隨著農產品質量標準和安全意識的提高，許多高毒和殘效期長的化學農藥被禁用和限用，更催生了生物農藥的研發(fā)速度。而且生物農藥源于自然，用于自然，一旦在土壤中建立優(yōu)勢，對土傳病原菌的拮抗和抑制作用是持續(xù)而穩(wěn)定的。加快研發(fā)新的生物農藥品種對確保蔬菜安全生產具有十分重要的意義。

山西省農業(yè)科學院農產品質量安全與檢測研究所的山西省農藥重點實驗室經10多年篩選研制的廣譜促生生物農藥B96-Ⅱ發(fā)酵液，經多年多點試驗得出，其對蔬菜枯萎病、疫病等土傳病害有明顯的防治效果，對多種蔬菜如蘆筍有明顯的促生效果[5-6]。為探明B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治效果，筆者就B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治及對植株的促生效果進行了室內、田間的系統(tǒng)試驗。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑及儀器

枯草芽孢桿菌B96-Ⅱ為山西省農科院農產品質量安全與檢測研究所的山西省農藥重點實驗室篩選、鑒定的廣譜拮抗菌[3]。B96-Ⅱ發(fā)酵液制作：B96-Ⅱ菌種經斜面菌種培養(yǎng)、種子培養(yǎng)液、發(fā)酵培養(yǎng)液發(fā)酵，使菌種濃度達到1010～1011cfu/mL，最高可達1012cfu/mL。

病原菌培養(yǎng)：（1）辣椒枯萎病。病原為Fusarium oxysporum Lecht.f.sp.vasinfectum Snyd.et hans，學名辣椒鐮孢霉，屬半知菌亞門真菌。（2）辣椒疫病。病原為Phytophthora capsici.leonian，學名辣椒疫霉，屬鞭毛菌亞門真菌。（3）辣椒黑斑病。病原為Alternaria alternata（Fr.）Keissl.，學名細交鏈孢，屬半知菌亞門真菌。這3種病菌均由山西省農藥重點實驗室分離、鑒定、保存。將辣椒疫病菌、辣椒枯萎病菌、辣椒黑斑病菌分別點接在0.4 cm厚、直徑9 cm的PDA培養(yǎng)平皿上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，菌絲基本布滿全皿。

所用試劑均購自太原市來寶生物工程有限公司。主要儀器有JD500-2型電子天平（沈陽龍騰）；MLS-3020全自動滅菌鍋（日本SANYOLabo Autoclave公司）；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱HDLRAPPARATUS公司）；OLYMPUSOP70顯微鏡（日本）。

1.2 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌和辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

根據文獻[7]的生長速率抑制法預試驗表明，起始濃度為100倍開始有差異。采用梯度稀釋法，用滅菌蒸餾水，將 B96-Ⅱ發(fā)酵液分別稀釋成 102，103，104，105，106，107，108倍 7 個系列濃度，并與 45 ℃的PDA培養(yǎng)基按比例混合均勻倒平皿，厚度為0.4 cm，使平皿中的 B96-Ⅱ發(fā)酵液終濃度為 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8cfu/mL。將預先培養(yǎng)好的辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌和辣椒黑斑病菌分別用0.4 cm直徑打孔器打片，并接入含有不同濃度B96-Ⅱ發(fā)酵液的培養(yǎng)皿中，對照為空白PDA培養(yǎng)基，每處理設6次重復。放28℃恒溫箱培養(yǎng)，分別在3，7，14，21 d用十字交叉法記錄病原菌直徑。以生長速率為指標，計算不同濃度下的生長速率抑制率。生長速率抑制率＝（處理后的生長速率-對照的生長速率）/對照的生長速率×100%。

1.3 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的田間防治效果

大田試驗于2011—2012年2 a在山西省太原市清徐縣集義鄉(xiāng)進行，該縣辣椒種植面積在1000hm2以上。辣椒移栽后1個月（6月20日），用稀釋500倍的B96-Ⅱ發(fā)酵液灌根，每穴灌500 mL，對照藥劑為500倍50%復方多菌靈，同時設空白處理。7月20日以同樣的方法進行第2次處理，共2次。小區(qū)面積60 m2，每處理重復3次。調查方法為隨機抽樣，每小區(qū)調查10個點，每點取10株，記錄發(fā)病率，計算防治效果。

1.4 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒的促生效果

處理方法、取樣方法、取樣時間同1.3。測定指標為植株高度、植株鮮質量、每株結椒數、每株辣椒總質量。經與對照比較，計算促生效果。

2 結果與分析

2.1 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒枯萎病菌的平皿抑制效果

試驗表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌有強烈而明顯的抑制作用。預試驗表明，B96-Ⅱ在100倍以上濃度，對辣椒枯萎病菌完全抑制。由圖1可知，B96-Ⅱ發(fā)酵液為100倍時，生長速率抑制率為93.22%，之后隨稀釋濃度增大，抑制效果略有下降，但下降幅度緩慢，在稀釋濃度為108倍時，其生長速率抑制率為62.71%。

2.2 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒疫病菌的平皿抑制效果

試驗結果（圖2）顯示，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒疫病菌有強烈而明顯的抑制效果。B96-Ⅱ發(fā)醇液在稀釋100倍時，辣椒疫病菌菌落生長緩慢，21 d菌落直徑不足2 cm；當稀釋到108倍時，對辣椒疫病菌仍有抑制能力，生長速率抑制率為71.07%。

2.3 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

由表1可知，B96-Ⅱ發(fā)酵液在稀釋102～108倍時，對辣椒黑斑病菌都有很強的抑制能力，生長速率抑制率為91.74%～97.52%。辣椒黑斑病菌在含有拮抗菌B96-Ⅱ的PDA梯度培養(yǎng)基上普遍生長緩慢，表現出很強的抑制力，培養(yǎng)21 d發(fā)現，B96-Ⅱ在高濃度處理平皿內（如100倍液）的菌落直徑小于14 d直徑，其他處理菌落也偶見空斑，經觀察屬于溶菌現象。

2.4 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的田間防治效果

于2011年8月26日辣椒病害發(fā)病盛期調查，用B96-Ⅱ發(fā)酵液500倍液2次灌根后，辣椒全田生長茂密，病株、死株很少，處理后35 d的防治效果為80.3%，處理后70 d的防治效果仍為78.3%，而復方多菌靈僅為8.4%（表2）。

表1 B96-II對辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

表2 B96-II對辣椒病害的田間防治效果

2.5 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒植株的促生作用

B96-Ⅱ對辣椒植株有明顯的促生作用，具體表現為：植株生長茂密，分枝多而長，與相鄰田塊和本村、本鄉(xiāng)同期種植戶比較形成明顯的差異。抽樣測定，B96-Ⅱ處理區(qū)植株較空白對照整體生物量增加33.5%（表3）。B96-Ⅱ發(fā)酵液處理后，辣椒結實率高，果實大而厚實，果實病斑率和壞死率也相對減少。

表3 B96-II發(fā)酵液對辣椒結實率和植株生物量的影響

2.6 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒植株的抗逆能力觀察

2011—2012年連續(xù)2 a試驗后發(fā)現，B96-Ⅱ發(fā)酵液處理區(qū)長勢好，辣椒厚實，不僅發(fā)病率低，而且生長期可延長20～30 d。辣椒在當地普通地塊10月上中旬生長期基本結束，植株干黃，而B96-Ⅱ處理田多在11月初植株才會出現干黃。另外，經歷2012年10月初的寒潮后，意外發(fā)現，B96-Ⅱ處理植株抗寒能力增強。具體表現為同鄉(xiāng)相鄰近的辣椒田在寒潮過后，已泛黃的整株葉片脫落，枝條被凍干，僅剩光稈和干癟的辣椒，而B96-Ⅱ發(fā)酵液處理區(qū)只輕微受凍，葉片零星脫落，干枝或光稈株少，依然以綠色為主。產量測定結果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液300～500倍處理區(qū)，辣椒干質量與對照相比，可增產5%～15%。

3 結論與討論

本研究室內試驗結果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌、辣椒黑斑病菌均有強烈的抑制作用。稀釋102～108倍均對3種病原菌菌絲有明顯的抑菌效果，尤其對辣椒黑斑病菌，在稀釋108倍時，抑制效果可達91.74%。說明B96-Ⅱ發(fā)酵液含菌量高（1011cfu/mL）且抑菌活性強。21 d的抑制效果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液有持續(xù)不斷的抑菌作用。在室內平皿培養(yǎng)條件下，對辣椒的3種病原真菌和B96-Ⅱ拮抗菌的生長都達到了最大限度的條件滿足。B96-Ⅱ發(fā)酵液在稀釋萬倍甚至上億倍時，雖然原始濃度不高，但由于B96-Ⅱ細菌繁殖速度快，很快建立了生長優(yōu)勢，因此，在3周或更長時間內表現出強烈的抑制作用。

室內試驗為B96-Ⅱ發(fā)酵液在田間應用濃度提供了依據。雖然在室內人工條件下，B96-Ⅱ的有效稀釋濃度可達到1億倍之多，但在自然環(huán)境條件下拮抗菌的生存會受到各方面的壓力。有研究表明，B96-Ⅱ能在田間存活定殖，定殖率在1%左右，隨生長環(huán)境和土壤微生態(tài)條件而變化[8]。其他相關研究也表明，高效拮抗菌常常在實驗室平板效果明顯，但在盆栽和田間效果不穩(wěn)定[9]，生防菌因受自然界的營養(yǎng)、溫度、濕度、酸堿度等諸多因素的影響，在田間存活率低，這也是效果不穩(wěn)定的主要因素。因此，田間使用濃度應比室內有效濃度高些。本研究田間試驗選擇300～500倍的B96-Ⅱ發(fā)酵液灌根，35d的防治效果為80.3%，同期多菌靈為37.9%，70 d B96-Ⅱ發(fā)酵液的防效為78.3%，說明濃度基本合適。為進一步提高B96-Ⅱ發(fā)酵液的使用濃度和對蔬菜土傳病害的防效，今后應在田間使用方法（如移栽前蘸根處理等方法）、該拮抗菌的田間定殖能力、定殖條件、逆境適應能力等方面進行馴化研究。

本研究連續(xù)2 a試驗表明，B96-Ⅱ對辣椒植株有明顯促生作用，表現為：田間生長茂密，封壟效果明顯，與未噴施植株相比，抗衰老、抗低溫能力明顯提高。B96-Ⅱ發(fā)酵液對植株的促生作用與前期對蘆筍等蔬菜的促生作用相同[10]，促生機制正在研究中。經室內和田間試驗表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治效果較好，是一種值得開發(fā)的生物農藥品種。

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