溫銀元，馮文新，尹美強，趙 娟，王計平，王玉國

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

補血草（Limonium sinuatum）是白花丹科補血草屬（Limonium Mill.）多年生或2年生草本植物，是目前天然干花類中作切花批量生產(chǎn)的花之一[1]。此外，其還具有觀賞與藥用價值[2]，可作為一種新興的朝陽產(chǎn)業(yè)。補血草一般采用種子繁殖，但其遺傳性十分特殊，具有大量的不孕枝，又具有同型雜交不孕的特性，種子結(jié)實率較低，限制了專業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快繁為國內(nèi)外市場提供種苗尤為重要[3-6]。關(guān)于補血草的組織培養(yǎng)國內(nèi)外已有報道[7-15]，但未見有以花梗為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究。

本試驗以補血草幼嫩帶節(jié)花梗為材料，在離體條件下研究不同激素對花梗愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化、繼代培養(yǎng)及生根的影響，建立和優(yōu)化離體再生體系，旨在為補血草快速繁殖、種質(zhì)資源保存及遺傳轉(zhuǎn)化提供有效的途徑和技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以臺灣引進(jìn)的補血草（Limonium sinuatum）的幼嫩帶節(jié)花梗為試驗材料。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將補血草幼嫩花梗剪成長2 cm左右的帶節(jié)小段，剪去葉片，無菌條件下，用70%酒精浸泡30 s、無菌水沖洗3次；然后用0.1%HgCl2溶液浸泡8 min，無菌水沖洗5次，吸干表面水分后接種于MS培養(yǎng)基（附加不同濃度配比的2，4-D和6-BA）；暗培養(yǎng)3 d后在光下培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，20 d時觀察、記錄愈傷組織的出愈率以及愈傷組織的質(zhì)量（大小、顏色、緊實程度），選擇適宜的激素配比。光照時間16 h/d，光照強度為3 000～4 000 lx。

1.3 誘導(dǎo)不定芽的分化

將愈傷組織接于附加不同濃度配比6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上，觀察、記錄愈傷組織芽的分化率以及芽的生長狀況，選擇適宜的激素配比。光照時間16 h/d，光照強度3 000～4 000 lx，溫度（ 25±2）℃。

不定芽誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生不定芽的愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)×100%；平均每塊愈傷組織誘導(dǎo)不定芽數(shù)＝產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/產(chǎn)生不定芽的愈傷數(shù)。

1.4 繼代培養(yǎng)

將分化的小苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)芽分化數(shù)和芽增殖率篩選適合補血草分化生長的最適激素配比和培養(yǎng)條件。

1.5 生根培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)產(chǎn)生大量的叢生芽，轉(zhuǎn)入不同無機鹽質(zhì)量濃度（ 1/4 MS，1/2 MS，MS）且含有不同濃度IBA的培養(yǎng)基（蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L）中，根據(jù)苗的生根率、株平均根數(shù)和根長來選擇適宜的激素配比和培養(yǎng)條件。

生根率＝生根植株數(shù)/接種株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對補血草花梗愈傷組織誘導(dǎo)影響

由表1可知，在不同激素配比的培養(yǎng)基中，補血草花梗都不同程度地形成愈傷組織，其誘導(dǎo)率、出愈速度、愈傷組織的色澤和質(zhì)地都各不相同，而在不含任何激素的MS培養(yǎng)基中幾乎不能誘導(dǎo)出愈傷組織。單獨附加6-BA或2，4-D時，愈傷組織出愈率均很低，但2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織頻率高于6-BA；2種激素配合使用時，6-BA質(zhì)量濃度為 0.5，1.0 mg/L，2，4-D質(zhì) 量濃 度為1.0，1.5，2.0 mg/L的6個配比愈傷組織出愈率均可達(dá)80%左右，出愈速度較快，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量較好；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，各配比的出愈率都很低，出愈速度較慢，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量較差。

表1 不同質(zhì)量濃度激素對補血草花梗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在 6-BA為 0.5～1.0 mg/L，2，4-D為 1.0～2.0 mg/L時，各激素配比均適用于愈傷組織的誘導(dǎo)，其中，以 MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2，4-D 2.0 mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為89.2%，出愈速度最快（12 d），產(chǎn)生的愈傷組織顏色翠綠，質(zhì)地緊密（圖1），其為補血草花梗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.2 激素6-BA與NAA對補血草不定芽的誘導(dǎo)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，接種在附加不同質(zhì)量濃度 NAA（ 0，0.1，0.5，1.0 mg/L）與 6-BA（ 0.5，1.0，2.0，4.0 mg/L）組合的 MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，其結(jié)果如表2所示。

表2 不同質(zhì)量濃度6-BA與NAA對不定芽誘導(dǎo)影響

由表2可知，MS基本培養(yǎng)基附加一定質(zhì)量濃度的6-BA和NAA有利于補血草不定芽的發(fā)生。由花梗誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代培養(yǎng)后3周左右，其表面和周邊出現(xiàn)較大顆粒，大多數(shù)為綠色和淺綠色，也夾雜少量淺褐色；接種約5周，在綠色或淺綠色顆粒上形成芽點，繼而分化出不定芽。當(dāng)6-BA單獨使用時，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率逐漸增加，6-BA增加至2.0 mg/L時效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到46.4%，此時平均每塊愈傷誘導(dǎo)不定芽數(shù)也達(dá)到最大，為2.5個；6-BA質(zhì)量濃度增加到4.0 mg/L時，不定芽誘導(dǎo)率及平均每塊愈傷誘導(dǎo)不定芽數(shù)又隨之下降。NAA加入到含6-BA的培養(yǎng)基中后，可提高不定芽的誘導(dǎo)率，愈傷組織培養(yǎng)在6-BA 2.0，4.0mg/L與NAA 0.1，0.5 mg/L組合的培養(yǎng)基上，不定芽的誘導(dǎo)率在61.4%～74.3%之間，每塊愈傷產(chǎn)生的不定芽數(shù)均大于3個，其中，以MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L的效果最佳，誘導(dǎo)率為74.3%，平均每塊愈傷誘導(dǎo)的不定芽數(shù)為3.6個（圖2）。

2.3 激素6-BA和NAA對補血草不定芽繼代培養(yǎng)與增殖的影響

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽和腋芽切成等高的小芽，接種在繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行分化增殖培養(yǎng)，結(jié)果列于表3。

表3 激素6-BA和NAA對補血草不定芽分化增殖的影響

從表3可以看出，在單獨使用6-BA時，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，補血草的分化率、增殖系數(shù)都增加，6-BA質(zhì)量濃度為1.5，2.0 mg/L時，分化率在70%以上，增殖系數(shù)大于3.0；高質(zhì)量濃度的6-BA不利于分化出的幼苗生長，如6-BA為1.0 mg/L時，平均苗高為2.86 cm，而6-BA為1.5，2.0 mg/L時，苗高度則分別降低至2.35，2.27 cm。NAA和6-BA配合使用可以提高補血草的分化率和增殖系數(shù)，促進(jìn)分化幼苗的生長，其中，以NAA 0.1～0.2 mg/L＋6-BA 1.5～2.0 mg/L時的效果最好，分化率大于85%，使幼苗數(shù)增加3倍以上（最高可達(dá)到4.80倍）（圖3）。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度增加到0.5 mg/L時，可以增加試管苗的高度，但分化率和增殖系數(shù)均降低，且產(chǎn)生的幼苗瘦弱，在以后的繼代培養(yǎng)中分化和增殖能力較差。

2.4 激素IBA對補血草生根的影響

由表4可知，在不同培養(yǎng)基上，補血草的生根率、株平均根數(shù)及根長都有所不同，其中，以1/2 MS的生根率最大。IBA以1.0 mg/L的效果最好，在1/2 MS＋I(xiàn)BA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基上，生根率高達(dá)100%；株平均根數(shù)為4.3條，最多的有8條；株平均根長為2.6 cm，最長的4.6 cm。當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，試管苗基部有愈傷組織產(chǎn)生，抑制根的形成，導(dǎo)致根基部加粗，根系短小。

表4 培養(yǎng)基及IBA對補血草試管苗生根的影響

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2，4-D 2.0 mg/L的培養(yǎng)基上，補血草花梗愈傷組織誘導(dǎo)率最高（ 89.2%），出愈速度最快（12 d），產(chǎn)生的愈傷組織顏色翠綠，質(zhì)地緊密，為補血草花梗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。6-BA與NAA配合使用，可提高補血草不定芽的誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)。不定芽誘導(dǎo)時，以MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L的效果最佳，誘導(dǎo)率為74.3%，平均每塊愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽數(shù)為3.6個。以NAA 0.1～0.2 mg/L＋6-BA 1.5～2.0 mg/L的繼代增殖效果最好，分化率大于85%，使幼苗數(shù)增加3倍以上。生根培養(yǎng)時，以1/2 MS＋I(xiàn)BA 1.0 mg/L＋蔗糖20 g/L的生根率最大，為100%。

［1］黃勇，張秀省，孟憲磊.野生花卉補血草屬及其開發(fā)利用[J].中國種業(yè)，2002（ 8）：42.

［2］湯新慧，沈敏.補血草屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（ 8）：1874-1876.

［3］李秀花.野生花卉二色補血草引種利用研究 [J].中國園林，2003（ 10）：78-80.

［4］許毅洪，李福生，趙洪濤.人工栽培二色補血草前景光明[J].植物雜志，2004（ 1）：12-13.

［5］鄧旺華，王雁.補血草屬植物在城市綠化中的應(yīng)用[J].中國城市林業(yè)，2006，4（ 2） ：58-60.

［6］陳佳瀛，杜秀達(dá).補血草的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38（ 6）：594.

［7］那淑芝，李云祥，甄占萱，等.二色補血草的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].承德民族師專學(xué)報，2003，23（ 2）：79-80.

［8］陳銀鳳，陳篙.二色補血草試管苗生根及移栽基質(zhì)研究[J].亞熱帶植物科學(xué)，2001，30（ 3）：37-39.

［9］倪躍元，朱錦文，趙曉藝.大花補血草優(yōu)株無性系的建立[J].植物生理學(xué)通訊，1996，32（ 3）：200.

［ 10］ Hsu NaiWen，Liu TsuHwie.Themicropropagation of Limonium wrightii（ Hance） O.Kuntze[J].Journal of the Chinese Society for Horticultural Science，2000，46（ 3）：277-286.

［11］ John F Seelye.Shoot regeneration from leaf discs of Limonium perigrinum usingthidiazuron[J].New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，1994，22：23-29.

［ 12］ Huang CL.In vitro propagation of Limonium wrightii（ Hance）KTZE.（Plumbaginaceae），an ethnomedicinal plant，fromshoottip，leaf-and inflorescence-node explants[J].In vitro Cellular and Development Biology-Plant，2000，36（ 3） ：220-224.

［13］柴慈江，史燕山，駱建霞，等.二色補血草組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（ 2）：27-28，31.

［14］楊麗莉，張曉，晉凡生，等.激素對萱草組織培養(yǎng)參數(shù)的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（ 8）：815-818.

［15］范小峰，楊穎麗，劉軍梅，等.黃花補血草愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].西北植物學(xué)報，2007，27（ 2）：257-261.