戎宏立 ，王長彪 ，李 倩 ，孟玉平 ，曹秋芬 ，3

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

核糖體蛋白質(zhì)（RP）是一種廣泛存在的RNA結(jié)合蛋白，它與核糖體RNA共同組成了核糖體。目前，已發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白有80多種。以往認(rèn)為，RP的功能僅僅是與核糖體RNA（rRNA）共同參與蛋白質(zhì)的合成，但近年來隨著技術(shù)手段的進(jìn)步和科學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)RP有諸多復(fù)雜的核糖體外功能，對于RP功能的探索成為科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

目前，研究發(fā)現(xiàn)的RP的核糖體外功能主要包括：調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化，參與胚胎發(fā)育，參與癌癥發(fā)生等[1-5]。曹秋芬等[6-10]已經(jīng)成功構(gòu)建了棗結(jié)果枝的cDNA文庫，并對水通道蛋白、金屬硫蛋白、抗壞血酸過氧化物酶等一些有研究價值的基因，進(jìn)行了表達(dá)載體的構(gòu)建、體外脅迫表達(dá)等一系列的研究分析。但是關(guān)于棗樹核糖體蛋白基因的分析目前尚處于空白階段。

本研究利用生物信息學(xué)手段對棗樹的核糖體蛋白基因進(jìn)行相關(guān)分析，對進(jìn)一步認(rèn)識棗樹的生物合成過程，查找其與其他物種的差異性，進(jìn)而發(fā)掘棗樹的優(yōu)良基因具有十分重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

棗樹結(jié)果枝ESTs序列來源于山西省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心曹秋芬課題組構(gòu)建的壺瓶棗（Ziziphusjujuba Millhupingzao）結(jié)果枝cDNA文庫。

1.2 方法

1.2.1 ESTs功能注釋 利用Blast2GO軟件對測序后的EST進(jìn)行功能注釋[11-12]。分析所用參數(shù)為:

BLAST：

Blast DB:nr；Number of Blast Hits:20；Blast Expect value:1e-25；Blast Program:blastx；Blast Mode:QBlast-NCBI；HSPLength cutoff:33.

Annotation configuration：

Pre-eValue-Hit-Filter:1e-25；Pre-Smiliarity-Hit-Filter:15；Annotation CutOff:55；GOWeight:5.

1.2.2 核糖體蛋白基因的分析[13-18]從經(jīng)過功能注釋的ESTs序列中篩選出核糖體蛋白基因，用Clustal x1.83進(jìn)行比對去除冗余序列，通過Blastx搜索NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫，序列相似性分析獲得具有完整ORF的棗核糖體蛋白基因；利用DNAStar軟件中的EditSeq程序分析棗樹核糖體蛋白基因的核苷酸、氨基酸序列的組成及理化性質(zhì)、查找開放閱讀框（ Open Reading Frame，ORF）并進(jìn)行翻譯；利用SOPMA在線工具完成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；利用在線軟件ProtScale Server和NetPhos 2.0 Server分別對棗核糖體蛋白基因的氨基酸序列疏水性/親水性及潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析；利用PSORT對棗樹核糖體蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用DNAStar軟件中的MegAlign程序通過氨基酸比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)為默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESTs功能注釋

通過篩選棗生長初期結(jié)果枝的cDNA文庫，選取長度500 bp以上的625個ESTs序列進(jìn)行測序，得到522個有用序列，其中，397個ESTs序列與NCBI中已知功能基因相似性較高，占76.1%；有125個ESTs是NCBI中沒有的未知序列，占23.9%。對397個已知功能的ESTs序列進(jìn)行分類整理，發(fā)現(xiàn)有42個基因含有2個以上的ESTs，重復(fù)表達(dá)的ESTs共77個，表達(dá)量最多的是40S核糖體蛋白，S27有6個ESTs，其次富含脯氨酸蛋白有5個ESTs，類萌蛋白有4個ESTs。本研究還發(fā)現(xiàn)，522個ESTs中，與抗氧化相關(guān)的基因有：超氧化物歧化酶、2-cys過氧化還原酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶；與抗逆相關(guān)的基因有：玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶、shaggy蛋白激酶、親環(huán)蛋白、gast蛋白、鋁誘導(dǎo)蛋白、富含脯氨酸蛋白、硫氧還蛋白、熱休克蛋白等（表1）。這些有用的棗結(jié)果枝抗逆相關(guān)基因需要進(jìn)一步研究分析，以期為棗樹的基因研究，品種選育、改良提供有力的試驗(yàn)依據(jù)。

表1 棗結(jié)果枝抗逆相關(guān)基因功能注釋

將397條有功能注釋的ESTs序列分成生物進(jìn)程 （Biological Process）、 細(xì)胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3個類型。從圖1可以看出，生物進(jìn)程中比例最大的是 metabolic process，其次是 cellular process；從圖2可以看出，細(xì)胞組分中占最大比例的是cell，其次為organelle；從圖3可以看出，分子功能中比例最大的是binding，其次是catalytic activity。3個類型的注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)反映出cDNA文庫中基礎(chǔ)代謝相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)合成表達(dá)量比較多；而本研究材料為棗生長初期的結(jié)果枝，其細(xì)胞生長旺盛，蛋白合成轉(zhuǎn)運(yùn)活躍，二者反映的情況是一致的。

320條ESTs通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝分析，得到123條ESTs的62個代謝途徑，其中，淀粉和蔗糖代謝途徑（Starch and sucrosemetabolism）最多（7條，5.69%），其次是卟啉和葉綠素代謝途徑（Porph-yrin and chlorophyll metabolism；6條，4.88%）（ 表2）。

表2 棗結(jié)果枝EST代謝途徑分析

2.2 核糖體蛋白基因的分析

篩選棗結(jié)果枝ESTs，去除冗余的序列，獲得24條具有完整ORF的核糖體蛋白ESTs。利用DNAStar軟件中的EditSeq程序分析它們的核苷酸、氨基酸序列組成及理化性質(zhì)，結(jié)果表明，24條核糖體蛋白基因中最長為60S核糖體蛋白L5，為912 bp；最短的為60S核糖體蛋白L29-1，為183 bp。而分子量最大的是50S核糖體蛋白L4，分子量為32 764.44，最小的是40S核糖體蛋白S30，分子量為6 931.12。核糖體蛋白多肽大多呈堿性，只有50S核糖體蛋白L12為弱酸性，其PI為5.55。用SOPMA預(yù)測棗核糖體蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是棗核糖體蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中。

用ProtScale Server對棗核糖體蛋白基因的氨基酸序列疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，介于－0.5～＋0.5之間的為兩性氨基酸。分析結(jié)果顯示，60S核糖體蛋白L29-1（圖4）多肽鏈整條都處于親水區(qū)域，其中，第36位的天冬氨酸（Asp）具有最高分值-0.611，第51位的天冬酰胺（Asn）親水性最強(qiáng)，具有最低分值-3.667；40S核糖體蛋白 S25（ 圖 5）、60S核糖體蛋白 L13-1（ 圖6）在N端具有一個明顯的親水區(qū)域；40S核糖體蛋白S30（圖7）多肽鏈中間有一個明顯的親水區(qū)域；其余的核糖體蛋白多肽鏈沒有明顯的親水區(qū)域或疏水區(qū)域，親水性氨基酸分布比較均勻，且數(shù)量大于疏水性氨基酸，因此，可推斷它們屬于可溶性蛋白。

利用在線工具NetPhos 2.0 Server分別對24個核糖體蛋白的氨基酸序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析，依據(jù)分值大于0.5的氨基酸位點(diǎn)都是磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果列于表3。由表3可知，24個序列都具有潛在的磷酸化位點(diǎn)，分別位于Ser，Thr和Tyr這3個氨基酸上，其中，Ser潛在的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最多。比較24個核糖體蛋白所具有的潛在磷酸化位點(diǎn)總數(shù)可知，50S核糖體蛋白L4的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最高，為19，其次為60S核糖體蛋白L5和50S核糖體蛋白L5，分別為18和16。

表3 棗核糖體蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)

利用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)椊Y(jié)果枝核糖體蛋白通過氨基酸比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖8所示。從圖8可以看出，24個基因分為2類，50S核糖體蛋白L6為一類；而其余的核糖體蛋白為一類，包括4個亞類，每一亞類的核糖體蛋白基因可能存在于同一基因上。

利用PSORT對24個核糖體蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果如表4所示。從表4發(fā)現(xiàn)，大部分核糖體蛋白定位于細(xì)胞核中。結(jié)合表4和圖8發(fā)現(xiàn)，在某些位于同一進(jìn)化分枝上的核糖體蛋白具有不同的亞細(xì)胞定位結(jié)果，說明它們之間可能具有不同的細(xì)胞學(xué)功能，比如50S核糖體蛋白L12和40S核糖體蛋白S27，50S核糖體蛋白L4和核糖體蛋白S8e位于同一進(jìn)化分枝上，但它們分別 定位在葉綠體和細(xì)胞核中。

表4 棗核糖體蛋白亞細(xì)胞定位

3 結(jié)果與討論

本研究通過對棗生長初期結(jié)果枝cDNA文庫中625個ESTs序列的測序，得到了522個有用序列，在397個與NCBI中已知功能基因相似性較高的EST中，發(fā)現(xiàn)了一些可能與棗樹抗寒、抗旱、抗逆性強(qiáng)密切相關(guān)的基因，比如超氧化物歧化酶，2-cys過氧化還原酶，過氧化物酶，抗壞血酸過氧化物酶，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶，shaggy蛋白激酶，親環(huán)蛋白，gast蛋白，鋁誘導(dǎo)蛋白，富含脯氨酸蛋白，硫氧還蛋白，熱休克蛋白等。

進(jìn)一步對24條核糖體蛋白基因分析表明，核糖體蛋白屬于可溶性蛋白，分子量在6 931.12～32 764.44之間，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是棗核糖體蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中。在24個核糖體蛋白中，50S核糖體蛋白L4的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最高，為19。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。本研究通過比較發(fā)現(xiàn)，位于葉綠體中的核糖體蛋白的磷酸化位點(diǎn)數(shù)普遍高于細(xì)胞質(zhì)中核糖體蛋白的磷酸化位點(diǎn)數(shù)，這可能與數(shù)量有限的葉綠體核糖體蛋白要發(fā)揮相對更多的功能有關(guān)。通過氨基酸比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，同一亞類的核糖體蛋白常常具有不同的亞細(xì)胞定位結(jié)果，說明它們之間可能具有不同的細(xì)胞學(xué)功能。

［1］田媛，張俊平.核糖體蛋白的新功能及其與相關(guān)疾病的關(guān)系[J].生命科學(xué)，2011，31（ 4）：488-491.

［2］朱可可，易聰，周興濤.核糖體蛋白基因協(xié)同表達(dá)的分子機(jī)制[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（ 35）：17376-17379.

［ 3］ Adam Amsterdam，Kirsten CSadler，Nancy Hopkins.Manuribosomal protein genesarecancergenes in zebrafish[J].Plos Biolo-gy，2004，2（ 5）：690-698.

［ 4］ Kristan K Steffen，Vivian L Mackay，Matt Kaebenriein.Yeast life span extension bydepletion of 60Sribosomal subunitsis mediated by Gcn4[J].Cell，2008，133（ 2）：292-302.

［ 5］ Alysonwmaclnnes，Adamamsterdam，Jacqueline Alees.Loss of p53 synthesis in zebrafish tumors with ribosomal protein gene mutations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America，2008，105（ 30）：10408-10413.

［6］孟玉平，曹秋芬，孫海峰，等.棗結(jié)果枝cDNA文庫的構(gòu)建與部分 ESTs分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（ 5）：102-106.

［7］張潔，楊大威，孟玉平，等.棗樹水通道蛋白基因生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)載體的構(gòu)建 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（ 1）：6-10.

［8］孟玉平，曹秋芬，孫海峰.棗樹ZjLFY基因cDNA片段的克隆與表達(dá)分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2010，27（ 5）：719-724.

［9］孟玉平，曹秋芬，孫海峰.棗樹花分生組織特異基因ZjAP1的克隆與表達(dá)分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（ 2）：6-11.

［10］郝子琪，許洪仙，孟玉平，等.棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因ZjAPX生物信息學(xué)分析及植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（ 5）：400-403.

［11］王長彪，郭旺珍.與棉纖維發(fā)育相關(guān)的EST生物信息學(xué)分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［12］鐘增明，李世東，高會蘭，等.鏈孢粘帚霉寄生核盤菌菌核相關(guān)基因的EST生物信息學(xué)分析 [J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（ 2） ：207-213.

［13］趙大球，曹春燕，孔芬，等.植物β-胡蘿卜素羥化酶的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（ 4）：116-121.

［14］吳春太，李維國，高新生，等.植物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物信息學(xué)分析[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，32（ 4）：83-89.

［15］李愛芹，李利斌，劉國明.一個番茄細(xì)胞分裂素受體類激酶基因的生物信息學(xué)分析 [J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，15（5）：1-3.

［16］柯濤，毛晗，惠豐立，等.油料作物EST資源的生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué)，2010，8（ 2）：165-174.

［17］薛永常，聶會忠，劉長斌.木質(zhì)素合成酶C3H基因的生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué)，2009，7（ 1）：13-17.

［18］林元震，郭海，黃少偉，等.火炬松DREB1基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué)，2010，8（ 1）：43-46.