王仁俊，溫美玲，寇正涌，李 華，郝錫聯(lián)，趙 卓，周 革，周曉馥

（吉林師范大學生命科學學院，吉林 四平 136000）

多種心血管疾?。ü谛牟　⒏哐獕旱龋┑慕K末階段都表現(xiàn)為慢性心力衰竭，是嚴重危害人類健康的心臟疾病.雖然臨床上采用β受體阻斷劑、腎素－血管緊張素醛固酮系統(tǒng)阻滯劑等對此有一定的治療作用，但其確診后四年病死率仍高達50%，目前仍缺乏有效的治療手段.

有研究顯示，慢性心衰的重要病理特征是交感傳出神經(jīng)興奮性增強［1］.導致心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮性增強的主要原因可能與中樞作用機制改變有關［2－5］.但是，在心衰狀態(tài)下延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）內(nèi)突觸遞質(zhì)與交感神經(jīng)活動增強的確切機制目前還不清楚.眾所周知，延髓頭端腹外側(cè)區(qū)是調(diào)節(jié)交感緊張性的重要神經(jīng)核團，許多神經(jīng)遞質(zhì)參與該部位的調(diào)節(jié)作用.目前認為抑制性反應主要是由γ－氨基丁酸（GABA）參與完成，并由GABAA和GABAB兩種受體介導，其中GABAB受體激活后通過G蛋白及第二信使系統(tǒng)，如cAMP或IP3介導K＋通道開放或Ca2＋通道關閉.在突觸后膜，K＋通道開放可誘導緩慢抑制性突觸后電位，而大多數(shù)分布在突觸前膜的GABAB受體主要通過關閉Ca2＋通道調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放.因此，無論在突觸前膜或突觸后膜的GABAB受體均參與介導抑制性效應.有研究表明RVLM的GABA緊張性抑制作用可通過GABAB受體產(chǎn)生［6］，而慢性心衰大鼠RVLM由GABAB受體介導的緊張性抑制作用是否發(fā)生改變，其內(nèi)在機制如何尚未見報道，本文對此進行了研究，以探尋防治慢性心力衰竭的新策略和新方法.

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體重180～200g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司.

1.2 藥品試劑與實驗設備

試劑：阻斷劑CGP－35348、巴氯芬、α－氯醛糖、滂胺天藍購于Sigma－Aldrich公司；肝鈉素購于北京鼎國生物技術公司.設備：多道生理記錄儀、大鼠腦立體定位儀、微操縱器.

1.3 心衰動物模型的建立

采用冠脈結(jié)扎方法誘導建立大鼠慢性心衰模型.在乙醚麻醉下將大鼠仰位固定于手術臺，自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠脈左前降支，以0號線立即結(jié)扎冠脈；將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，迅速關閉胸腔，開胸時間不超過30s.假手術組僅置縫線而不結(jié)扎冠脈.術后前3d，肌注青霉素.術后6～8周對假手術對照大鼠與心衰模型大鼠進行數(shù)據(jù)檢測.

1.4 實驗分組

動物隨機分為兩大組：（1）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348組，其中分假手術組（n＝7）和心衰組（n＝8）.（2）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬組，其中分假手術組（n＝6）和心衰組（n＝8）.

1.5 左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）、血壓（BP）和心率（HR）的記錄

腹腔注射烏拉坦（0.75g／kg）和α－氯醛糖（70mg／kg）麻醉，如需要可靜脈補充α－氯醛糖（0.3g／kg）麻醉，右頸總動脈插管，通過壓力換能器連接到多道生理記錄儀，同步采集LVSP（左心室收縮壓）、LVEDP和±dp／dt等各項指標，記錄完左心室舒張末期壓后，將聚乙烯導管退出心室，可進一步記錄動脈血壓，記錄大鼠標Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步得到心率.

1.6 延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射及核團定位

將動物俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，參照Paxions＆Waston大鼠腦圖譜［7］，在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（前囟后11.9～12.7mm，L和R 2.0～2.2mm，H 8.4～8.8mm）微量注射200nL相同體積的溶劑（vehicle）人工腦脊液（pH＝7.4），并先后分別微量注射200nL GABAB受體阻斷劑或激動劑，從每次注射完成后開始計時，連續(xù)觀察BP和HR對微量注射藥物或人工腦脊液的反應，每次給藥時間間隔30min.微注射實驗完畢，用過量麻醉劑將動物處死.將2%滂胺天藍溶液（50nL）緩慢注入延髓頭端腹外側(cè)區(qū).剪取頭顱，去除顱骨，將腦組織固定于10%甲醛溶液中，3d后作冰凍切片（厚度為30μm），染色，使用體視顯微鏡觀察藥物是否進入延髓頭端腹外側(cè)區(qū)，定位偏離RVLM者不列入統(tǒng)計.

1.7 心肌梗死面積測定

上述實驗完成后取出心臟，－20℃保存.心肌梗死面積詳細測定步驟參見文獻［8］.

1.8 大鼠RVLM組織取材

用過量麻醉劑將假手術組和心衰組大鼠處死，取腦并迅速轉(zhuǎn)移至干冰上冰凍.用冰凍切片機在RVLM核團所在位置連續(xù)切6張100μm厚的腦片，用12號針頭在腦片上RVLM核團所在位置雙側(cè)總共打12個孔.針頭內(nèi)的組織即為RVLM核團組織.

1.9 Western bolt檢測

取假手術組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)腦組織分別加入蛋白提取緩沖液（10mmol／L Tris，1mmol／L EDTA，1%SDS，0.1%Triton X－100和1mmol／L PMSF），超聲粉碎，37℃孵育30min；4℃10000r／min離心2min；上清液即為全細胞蛋白，Bradford法測定蛋白濃度；各組等量蛋白樣品經(jīng)SDS－PAGE分離后，三明治法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；用封閉液（含5%脫脂奶粉TBST）室溫封閉；分別用一抗GABAB受體1a和1b亞型抗體（1∶500，rabbit polyclonal），GAPDH（1∶1000），室溫和4℃孵育過夜后，膜用TBST洗滌干凈.然后用1∶4000稀釋的紅外熒光標記二抗（Alexa Fluor 800或Alexa Fluor 700）分別對膜避光孵育1h，利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白進行檢測.

1.10 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)都用平均數(shù)±標準誤表示，注射前和注射后比較的數(shù)據(jù)分析使用配對t檢驗做統(tǒng)計學處理.為比較BP和HR對微注射不同劑量激動劑或阻斷劑的組內(nèi)差異，重復檢驗ANOVA Dunnett's post hoc test.假手術組和心衰組之間原始數(shù)據(jù)和參數(shù)的相對改變采用二元ANOVA Bonferroni's post hoc test檢驗.

2 結(jié)果

2.1 心衰與假手術大鼠整體生理學指標

大鼠心臟標本病理分析發(fā)現(xiàn)，心衰組大鼠心臟重量、體重和肺濕重與假手術組相比明顯增加（P＜0.05），結(jié)果提示心衰大鼠出現(xiàn)水潴留.與肺淤血假手術組相比，心衰組大鼠左心室心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05），心梗面積在30%～40%之間；假手術組大鼠左心室心肌未見明顯損傷.心衰組大鼠左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）明顯低于假手術組；而心衰組大鼠左室舒張末期壓卻明顯高于假手術組（P＜0.05）（見表1）.以上結(jié)果提示心衰組大鼠的心臟收縮和舒張功能減退，這些表現(xiàn)與臨床慢性心衰癥狀相近.

表1 心衰與假手術大鼠整體生理學指標檢測結(jié)果

2.2 注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348

與溶劑對照組相比，假手術組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348導致心率和血壓呈劑量依賴性升高（P＜0.05）（見圖1），但與假手術組相比，心衰組心率和血壓升高幅度顯著減?。≒＜0.05）（見圖1）.心率和血壓對CGP－35348開始反應的時間是2.5～3.5min，峰值出現(xiàn)在微量注射后的5～6min內(nèi)，而恢復至給藥前水平的時間是在20～25min內(nèi)，并且心衰組大鼠BP和HR的恢復時間為（22.1±1.9）min，與假手術組恢復時間（23.2±1.7）min無顯著差異（P＞0.05）.

圖1 假手術組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射CGP－35348對血壓和心率的影響

2.3 注射GABAB受體激動劑巴氯芬

與溶劑對照組相比，假手術組和心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬導致心率、血壓呈劑量依賴性下降（P＜0.05）（見圖2）；但與假手術組比，心衰組心率和血壓下降幅度顯著減?。≒＜0.05）（見圖2）.心率和血壓對巴氯芬產(chǎn)生反應的谷值出現(xiàn)在微量注射后的4～5min內(nèi)，而心率和血壓下降的效應在微量注射后的25～35min內(nèi)恢復至給藥前的基線水平，并且心衰組大鼠BP和HR對延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬產(chǎn)生反應的潛伏期（3.9±0.8）min，與假手術組潛伏期（4.1±0.7）min無明顯差異（P＞0.05）.

圖2 假手術組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射巴氯芬對血壓和心率的影響

2.4 檢測大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達量

因為1a和1b兩種亞型是GABAB受體的主導優(yōu)勢亞型［9－10］，故分別在6只假手術組和6只心衰組大鼠中，使用Western bolt技術檢測假手術組、心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達量.研究結(jié)果顯示心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達量與假手術組相比發(fā)生下調(diào)（P＜0.05）（見圖3）.

圖3 假手術組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達量

3 討論

本項研究工作證實心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體介導的交感緊張性調(diào)節(jié)作用減弱.在大鼠單側(cè)RVLM微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬導致BP下降和HR減慢，這可能是微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬后，交感神經(jīng)的傳出活動受到抑制而引發(fā)的，該結(jié)果與Amano等人的報道相一致［11］.相比較而言，于大鼠RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348，卻引起HR加快、BP升高，這可能是與微量注射GABAB受體阻斷劑后，交感神經(jīng)的傳出活動去抑制有關，該結(jié)果與周蘇婭等人的報道相一致［6］.值得注意的是與假手術組相比，心衰組RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑后心率、血壓升高幅度顯著降低，而微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬使心率、血壓下降幅度顯著減少，結(jié)果提示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導的緊張抑制作用發(fā)生鈍化.這種RVLM的GABAB受體介導的交感縮血管緊張抑制作用的功能減弱可能是使交感神經(jīng)興奮性增強的作用機制之一.

為進一步解釋心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱的確切機制，本文進行了Wertern blot檢測實驗，Western blot結(jié)果顯示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導的緊張性抑制作用發(fā)生鈍化，與GABAB受體的表達量下調(diào)有關.此外，心衰大鼠RVLM GABAB受體功能減弱存在以下幾種可能機制：（1）在慢性心衰狀態(tài)下，某些激素或神經(jīng)遞質(zhì)水平升高，可降低RVLM內(nèi)GABAB受體的功能.（2）受體的親和力、磷酸化狀態(tài)以及亞基的組成可能與心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱有關.（3）幾種突觸遞質(zhì)效應如：突觸前GABA合成或釋放的減少、GABA降解的增加以及GABA與其受體的異常作用都可能導致GABAB受體功能的改變，進而引起交感興奮性增強.（4）心衰狀態(tài)下一氧化氮（NO）－GABA機制也可影響交感神經(jīng)的緊張性作用.

根據(jù)組織學鑒定，我們認為在RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體激動劑或阻斷劑所引起的BP和HR的改變，都是RVLM內(nèi)特異性的，即這些效應并不是注射時的機械刺激或酸堿化學刺激所致，因為微量注射相同體積的人工腦脊液（pH＝7.4），對BP和HR均無明顯影響.同時該效應與藥物擴散達到RVLM鄰近部位也無關，因為向RVLM鄰近部位注入相同體積和pH值的GABAB受體激動劑或阻斷劑，對BP和HR并無明顯影響；并且該效應也非藥物進入血液循環(huán)作用于其他外周器官組織所引發(fā)，因為我們直接向靜脈內(nèi)注射了2.5倍于RVLM內(nèi)微量注射最高劑量濃度的GABAB激動劑或阻斷劑，發(fā)現(xiàn)BP和HR均未發(fā)生顯著變化.

總之，本研究顯示慢性心衰狀態(tài)下RVLM內(nèi)GABAB受體介導的交感傳出抑制作用發(fā)生鈍化與GABAB受體的表達量下調(diào)有關，結(jié)果提示RVLM內(nèi)GABAB受體功能的減弱和GABAB受體的表達量下調(diào)是心衰狀態(tài)下心血管功能異常（如交感興奮性增強等）的重要病理機制之一.

［1］COHN J N，LEVINE T B，OLIVARI M T，et al.Plasma norepinephrine as a guide to prognosis in patients with chronic congestive heart failure［J］.N Engl J Med，1984，311：819－823.

［2］ZHANG K，LI Y F，PATEL K P.Reduced endogenous GABA－mediated inhibition in the PVN on renal nerve discharge in rats with heart failure［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，282（4）：1006－1015.

［3］WANG REN－JUN，ZENG QING－HUA，WANG WEI－ZHONG，et al.GABAAand GABABreceptor－mediated inhibition of sympathetic outflow in the paraventricular nucleus is blunted in chronic heart failure［J］.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2009，36（5）：516－522.

［4］王仁俊，寇正涌.運動訓練改善心衰大鼠室旁核GABAA受體介導的交感傳出抑制作用［J］.東北師大學報：自然科學版，2009，41（3）：107－113.

［5］王仁俊，韓俊杰.運動訓練改善心衰大鼠室旁核GABAB受體介導的交感傳出抑制作用［J］.吉林師范大學學報：自然科學版，2009，30（1）：65－68.

［6］周蘇婭，黃德明，陳應城.延髓頭端腹外側(cè)區(qū)調(diào)節(jié)心血管活動的γ－氨基丁酸機制［J］.浙江醫(yī)科大學報，1998，27（5）：193－196.

［7］PAXIONS G，WATSON C.The rat brain in stereotoxic coordinates［M］.New York：Academic Press，1986.

［8］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：921－922.

［9］BETTLER B，KAUPMANN K，MOSBACHER J，et al.Molecular structure and physiological functionsof GABA（B）receptors［J］.Physiol Rev，2004，84（3）：835－867.

［10］MARGETA－MITROVIC M，MITROVIC I，RILEY R C，et al.Immunohistochemical localization of GABA（B）receptors in the rat central nervous system［J］.J Comp Neurol，1999，405（3）：299－321.

［11］AMANO M，KUBO T.Involvement of both GABAAand GABABreceptors in tonic inhibitory control of blood pressure at the rostral ventrolateral medulla of the rat［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1993，348（2）：146－153.