盧月美 鞏前明 梁 吉 聶慶東

(1福州大學機械工程及自動化學院，福州 350108)

(2清華大學機械工程系，北京 100084)

(3清華大學校醫(yī)院，北京 100084)

0 引 言

心腦血管疾病已成為目前威脅人類健康和生命的“頭號殺手”，而研究發(fā)現(xiàn)血漿中的低密度脂蛋白(LDL)水平與心腦血管疾病的發(fā)生率呈正相關(guān)[1-3]?；谖阶饔玫难汗嗔魇乾F(xiàn)今治療高LDL的理想選擇[4-5]。人血中的LDL在正常生理pH環(huán)境下是直徑為18～25 nm的球形顆粒體，表面既有正電荷富集區(qū)又有疏水區(qū)[6]，因此要想通過吸附劑與LDL之間的特異性作用選擇性吸附LDL，則吸附劑的孔結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)是關(guān)鍵。

目前國外研制并臨床應用的LDL血液灌流吸附劑有日本Kaneka公司的Liposorber系列 (其中的吸附劑是以球形纖維素為載體，以硫酸右旋糖酐為配基)[7-8]及德國Fresenius公司的DALI系統(tǒng)(聚丙烯酸覆蓋的聚丙酰胺柱全血吸附劑)[9-10]。這些吸附劑是通過吸附劑表面的酸性基團與LDL之間的靜電結(jié)合作用來吸附LDL，雖然它們對LDL有較好的吸附能力和良好的血液相容性，但存在價格昂貴的缺點[11]，給LDL血液灌流的人群帶來了很大的經(jīng)濟負擔，難以在我國臨床上廣泛應用。而國內(nèi)對LDL吸附劑的研究報道有南開大學，重慶大學，華東理工大學，四川大學，上海海洋大學等課題組，他們或以酸性基團為配基，制得負電型LDL吸附劑[11-20]；或以吲哚-3-乙酸、色氨酸、十二醇或膽固醇等為配基制得疏水型LDL吸附劑[21-25]；或既有負電性配基又有疏水性配基的雙親型LDL吸附劑[26-30]。這些吸附劑雖然對LDL的有一定的吸附能力，但均以現(xiàn)有的大孔樹脂為載體(多孔殼聚糖、葡聚糖、纖維素微球，大孔珠狀聚乙烯醇或聚丙烯酰胺微球等)，其孔結(jié)構(gòu)不是專門針對LDL的，且都仍處于實驗室研究階段。因此有必要開發(fā)一種孔結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)均適合LDL的專用LDL吸附劑。

多壁碳納米管(CNTs)具有發(fā)達的中、大孔和高的比表面積，研究表明其對中分子物質(zhì)不僅具有優(yōu)異的吸附能力，而且吸附速率快[31]。碳納米管作為生物醫(yī)學材料使用時，具有良好的血液相容性[32,33]。另外，碳納米管表面易于修飾，可以共價鍵或非共價鍵的方式修飾各種基團[34-39]，可以通過與LDL之間的特異性作用來選擇性吸附LDL。且隨著碳納米管制備和純化技術(shù)的成熟，宏觀量合成碳納米管已成為可能，碳納米管的應用成本也越來越低。因此碳納米管有望成為良好的新型LDL血液灌流吸附劑載體材料。

L-色氨酸(L-Trp，C11H12N2O2)，含有吲哚基團，具有疏水性，可以與LDL表面的疏水區(qū)域(未酯化膽固醇區(qū))之間的疏水作用來識別LDL。同時L-Trp還含有弱酸性的羧酸，修飾至復合微球后可同時改善復合微球的親水性；另外，L-Trp還含有活性氨基，這有利于與其它活性基團的反應，實現(xiàn)與復合微球的連接。另L-Trp本身就是人和動物生命活動中8種必需氨基酸之一，被廣泛應用于醫(yī)藥，食品及飼料添加等領(lǐng)域，所以修飾L-Trp不會對人體造成不良的影響。因此L-Trp應是LDL吸附劑良好的配基。

本文以具有良好球形度和一定強度的多孔碳納米管/活性炭(CNTs/AC)復合微球為載體，采用環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法修飾L-Trp，制備出含有一定配基數(shù)量的CNTs/AC復合微球(L-CNTs/AC)，并進行LDL吸附試驗，以期得到具有良好吸附能力的LDL吸附劑。

1 實驗部分

1.1 主要原材料

多壁碳納米管(CNTs，自制，化學氣相沉積法制備并混酸 (濃硫酸與濃硝酸)純化，外徑約為20～40 nm，內(nèi)徑～10 nm)；線型酚醛樹脂(化學純，中科院化學所)；六次甲基四胺(分析純，北京益利精細化學品有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；聚乙烯醇(PVA)(平均聚合度：1750，北京益利精細化學品有限公司)；苯磺酰氯(化學純，上海金山亭新化工試劑廠)；濃硫酸(95．0%～98．0%，分析純，北京化工廠)；濃硝酸(65．0%～68．0%，分析純，北京化工廠)；L-色氨酸(L-Trp，生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；環(huán)氧氯丙烷(ECH，分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(分析純，北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司)；其它試劑均為市售分析純試劑。高LDL病人血清(清華大學校醫(yī)院提供)。

1.2 碳納米管/活性炭復合微球修飾L-色氨酸

首先采用懸浮聚合、炭化、活化的方法制備得到不同碳納米管加入量的碳納米管/活性炭(CNTs/AC)復合微球[40]。將不同加入量(占酚醛樹脂的質(zhì)量分數(shù))的CNTs超聲分散在無水乙醇中(KS-900F超聲波細胞粉碎機(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)，功率450 W，頻率20 kHZ，碳納米管分散時間為9 h)，然后將酚醛樹脂和六次甲基四胺 (占酚醛樹脂的20wt%)溶于碳納米管乙醇溶液中，制得均勻分散相。150 mL 0．3wt%SDS 及 1．89wt%PVA 的混合水溶液為連續(xù)相。將分散相在600～700 r·min-1機械攪拌作用下加入70℃的連續(xù)相中，攪拌混合液20 min后升溫至96℃恒溫攪拌3 h，酚醛樹脂在苯磺酰氯催化下完全固化。依次用去離子水、無水乙醇清洗，烘干后即獲得碳納米管/酚醛樹脂復合微球。將此微球在600℃下炭化、水蒸氣850℃下活化90 min制得CNTs/AC復合微球。

其次采用環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法修飾L-Trp。(1)復合微球上引入羥基：將體積量是復合微球質(zhì)量40倍的濃硝酸于70℃水浴下浸泡氧化2 h，清洗烘干后備用；(2)環(huán)氧氯丙烷(ECH)活化復合微球，通過羥基引入環(huán)氧基團(如圖1(a))：將0．100 g樣品與 20 mL DMSO，5 mL ECH，20 mL 1．4 mol·L-1的 NaOH 溶液混合均勻后于40℃下反應2 h；(3)偶聯(lián)L-Trp(如圖1(b))：0．6 g L-Trp，5 mL 1．4 mol·L-1NaOH，20 mL 0．1 mol·L-1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液超聲混勻后加入ECH活化的樣品，65℃下反應15 h，生理鹽水、去離子水清洗至中性，60℃真空干燥24 h以上即得到修飾了L-Trp的CNTs/AC復合微球。

1.3 復合微球的表征

采用德國LEO-1530型熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察微球的形貌及EDS能譜定性分析微球的表面元素種類；采用美國Thermo Electron公司Sorptomatic 1990型分析儀在77 K下測定多孔微球的氮氣吸脫附曲線，由脫附曲線用Barrett-Joyner-Halen(BJH)模型得到多孔微球的孔結(jié)構(gòu)。采用美國PerkinElmer公司Spectrum Gx型傅立葉紅外拉曼光譜儀 (分辨率：4 cm-1)、美國 TA Instruments公司Q5000IR型熱重分析儀、美國PERKING-ELMER Physics Electronics公司的PHI5300型X射線光電子能譜表征復合微球的L-色氨酸的修飾效果。

采用北京瑞利分析儀器廠的UV9100型紫外-可見分光光度計測定L-色氨酸的濃度，制得L-色氨酸濃度-吸光度的標準曲線 (相關(guān)系數(shù)R2為0．999 6)，而后得到 L-Trp 濃度 c(μg·mL-1)與吸光度 A 的關(guān)系為：

而后根據(jù)578 nm處測得的吸光度值，由式(1)計算得到不同碳納米管加入量的復合微球所修飾的L-Trp 的濃度 c(μg·mL-1)。

1.4 復合微球?qū)DL的吸附實驗

采用體外靜態(tài)吸附法進行LDL吸附實驗。將0．04 g不同CNTs加入量的L-CNTs/AC復合微球在生理鹽水中充分浸泡24 h，然后吸干水分，加入1．0 mL左右的高LDL血清，于37℃下恒溫振蕩2 h。用日本7170型全自動生化分析儀測定吸附前、后血清中的LDL含量，吸附效果用吸附量(AQ(mg·g-1))來表征，其計算方法如式(2)。

式中，c0—吸附前血清中LDL-C的濃度 (mmol·L-1)；

ct—吸附后血清中 LDL-C 的濃度(mmol·L-1)；

圖1 CNTs/AC復合微球的環(huán)氧氯丙烷活化(a)及偶聯(lián)L-Trp(b)Fig．1 Activation by epichlorohydrin(a)and coupling with L-Trp(b)of CNTs/ACcomposite beads

V—靜態(tài)吸附中所加的血清量(mL)；

W—靜態(tài)吸附中所用吸附劑的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 復合微球的孔結(jié)構(gòu)

以酚醛樹脂為粘結(jié)劑的懸浮聚合法、炭化及活化法可制得球形度良好，粒徑合適、強度適中的CNTs加入量高達45wt%的CNTs/AC復合微球，如圖2(a)所示。

由圖2(b)復合微球的孔徑分布圖可見，未加CNTs的酚醛基活性炭微球，中、大孔孔容極?。浑S著CNTs加入量的增加，中、大孔的孔容增大，尤其是20～100 nm的孔容顯著增多。CNTs本身的堆積孔是復合微球中直徑為20～100 nm孔形成的主要原因，如圖2(c)所示。

圖2 CNTs/AC復合微球的宏觀形貌(a)孔徑分布(b)及復合微球中CNTs形成的堆積孔(c)Fig．2 Morphology(a)pore size distribution(b)and aggregated pores of CNTs(c)of CNTs/ACcomposite beads

2.2 復合微球修飾的L-色氨酸

在修飾了L-Trp的復合微球微觀形貌照片中可以看到復合微球的表面出現(xiàn)了針狀物質(zhì) (如圖3(a)所示)，通過X射線能譜(圖3(b))發(fā)現(xiàn)在復合微球表面上不僅含有較明顯的氧元素，而且出現(xiàn)了氯元素，這應是ECH活化復合微球后在復合微球上存在的未偶聯(lián)L-Trp的環(huán)氧基團。

圖4為復合微球修飾L-Trp前后的傅立葉紅外光譜圖，修飾了L-Trp之后，由硝酸氧化得到羥基的吸收峰變?nèi)趿?，這是因為羥基在ECH活化環(huán)節(jié)被環(huán)氧基活化了。而在3 434 cm-1處出現(xiàn)了一個較弱的吸收峰，這可能是引入環(huán)氧基團后的N-H伸縮振動峰。1 571 cm-1是石墨烯C的紅外基頻模，出現(xiàn)了明顯的藍移。1 698 cm-1處的吸收峰可能為N-酰化氨基酸的-C=O和羧酸中的羰基疊加峰[41]；1 200 cm-1是C-O的伸縮振動；而742 cm-1為色氨酸的苯環(huán)鄰位雙取代峰[42]。這說明了復合微球表面修飾有LTrp。

從圖5可以看出，修飾了L-Trp之后，300℃之后的失重比濃硝酸氧化態(tài)的復合微球有了明顯的增大，這是因為300℃之后修飾上的L-Trp上的基團也參與了熱分解造成的。

由復合微球的XPS全譜圖(圖6(a))可見，在修飾L-Trp之前，復合微球中沒有氮(N)元素，偶聯(lián)L-Trp后出現(xiàn)了明顯的氮元素，且氧(O)元素的含量也增多。由XPS作表面元素半定量分析表明，修飾了LTrp的復合微球中表面元素nN/nC比為2．1/100。

圖3 40wt%CNTs/AC復合微球修飾L-Trp后的微觀形貌(a)及能譜圖(b)Fig.3 Morphology(a)and energy spectra(b)of 40wt%L-CNTs/ACcomposite beads

圖4 30wt%CNTs/AC復合微球修飾L-Trp前后的傅立葉紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy of 30wt%CNTs/ACcomposite beads

圖5 30wt%CNTs/AC復合微球修飾L-Trp前后的熱失重曲線Fig.5 Thermogravimetric curves of 30wt%CNTs/AC composite beads

將修飾了L-Trp的樣品各元素的XPS窄譜進行計算機擬合分析，其中C1s的XPS峰可分解為：284．7，285．2，286．9 eV 及 288．0 eV(圖 6(b))，分別歸屬于C-C，C-H，C-N，-COOH基團的C1s峰。由于修飾了L-Trp，使得C-C峰的比例僅有34.83%(如表1所示)，C-H鍵的比例占多數(shù)，達58.41%。O1s的結(jié)合能為 532.5，533.0 eV(圖 6(c))，分別是復合微球表面的C-OH和/或C-O-C基氧；N1s在400.4 eV(圖6(d))的峰值是由于σ*(N-H)響應，而在406.3 eV處是由于σ*(N-C)的響應[43-44]。這些都表明了L-Trp已成功地偶聯(lián)到復合微球上。

隨著對復合微球的修飾處理 (活化-氧化-修飾基團)，復合微球的晶化程度(R值)也在不斷變化。30wt%CNTs/AC復合微球活化態(tài)的R值為2.378，氧化態(tài)的R值增大為2.467，而修飾了L-Trp之后，R值增大到2.473，這表明了復合微球的表面修飾(氧化處理、修飾L-Trp)會使復合微球的缺陷增多(R值增大)。這是因為氧化處理在復合微球表面引入了含氧官能團，修飾L-Trp的處理過程則引入了吲哚基團和羧基等，這些異質(zhì)原子的引入使微球的缺陷增多，晶化程度下降，這樣復合微球的表面活性增強，有利于吸附的進行[45]。

修飾處理不僅改變了復合微球的表面性質(zhì)，而且對復合微球的強度也產(chǎn)生了一定的影響。由表2可見，修飾會使復合微球的強度受到損失，氧化處理使強度降低較嚴重，但修飾L-Trp的過程不會明顯降低強度?？傊砻嫘揎椫髲秃衔⑶虻膹姸仁俏葱揎椙暗募s50%，仍能滿足血液灌流的要求(＞5N)。

2.3 L-CNTs/AC復合微球?qū)DL的吸附性能

從圖7中可以看出，L-CNTs/AC復合微球?qū)DL的吸附量隨著CNTs加入量的增加而不斷增大。當CNTs加入量達45wt%時(本文所制備復合微球的最高 CNTs加入量)，LDL 吸附量達 4.623 mg·g-1，是未添加碳納米管的2.3倍多，且LDL吸附能力還有隨CNTs加入量增多而增大的趨勢。

圖6 修飾L-Trp的30wt%CNTs/AC復合微球的XPS全譜圖(a)C1s(b)O1s(c)及N1s(d)Fig．6 Survey spectrum(a)C1s(b)O1s(c)and N1s(d)of 30wt%L-CNTs/ACcomposite beads by X-ray photoelectron spectroscopy

表1 修飾L-Trp的30wt%CNTs/AC復合微球碳峰的XPS半定量分析Table 1 XPSsemi-quantitative analysis about Carbon peaks of 30wt%L-CNTs/AC composite beads

表2 修飾處理對CNTs/AC復合微球抗壓強度的影響Table 2 Effect of modification on the compressive strength of the CNTs/AC composite beads

L-CNTs/AC復合微球是依靠所修飾的L-Trp上的吲哚基團與LDL表面層的未酯化膽固醇區(qū)之間的疏水作用來識別并吸附LDL的，因此復合微球上配基的數(shù)量對復合微球吸附LDL來說是至關(guān)重要的。另外，由于LDL是一種大分子(18～25 nm的球形顆粒體)，所以復合微球內(nèi)部大中孔(20～100 nm)的孔容也是復合微球?qū)DL吸附能力的關(guān)鍵因素。

CNTs加入量的增多有利于復合微球上所能修飾上的配基-L-Trp修飾量的增大，當CNTs加入量為 0、10wt%、30wt%、40wt%、45wt%時， 所能修飾上L-Trp 的量分別為 4．8、4．9、5．1、5．6、6．0 μg·mL-1。 這是因為混酸處理的CNTs表面缺陷多，表面具有易于修飾。由于配基修飾量增大，復合微球的親水性得到了明顯改善 (修飾L-Trp后復合微球可充分浸泡于血清中，而修飾L-Trp前復合微球則是漂浮于血清之上)，這有利于復合微球與LDL分子的充分接觸，有利于增強與LDL之間的疏水作用力的發(fā)揮，對LDL吸附能力增強。另外，隨著CNTs加入量的增加(＞20wt%)，復合微球中適合吸附LDL的孔容(20～100 nm)增多(如圖 2(b)所示)。因此，此時復合微球?qū)DL的吸附能力顯著增強。

總之，CNTs在復合微球吸附LDL的過程中起到了兩個方面的重要作用 (如圖8所示)，一方面CNTs本身形成的堆積孔促進復合微球中20～100 nm孔的形成，這些中大孔在復合微球中互相連通，構(gòu)建了通暢的LDL擴散通道，從而進一步促進LDL吸附過程的進行；另一方面CNTs又可作為配基的載體，促進L-Trp配基修飾量的增多，L-Trp上的吲哚基團通過疏水作用特異性吸附血清中LDL，從而促進LDL在CNTs堆積孔間的吸附。

表3 修飾配基對40wt%CNTs/AC復合微球孔結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of modification on the pores structure of 40wt%CNTs/AC composite beads

圖7 不同CNTs加入量的修飾了L-Trp的復合微球?qū)DL的吸附量Fig．7 LDL adsorption amount on L-CNTs/ACcomposited beads with different CNTs mass ratio

圖8 CNTs在吸附LDL過程中所起作用示意圖Fig．8 Role of CNTs in the process of LDL adsorption

但當CNTs加入量達40wt%以上時，LDL吸附量增長緩慢，這與修飾配基后復合微球孔結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)：由于修飾處理不同程度地引入了異質(zhì)原子，這些異質(zhì)原子會占據(jù)原有孔腔的部分位置，從而使復合微球的各孔孔容均有所降低 (如圖9所示)。40wt%L-CNTs/AC復合微球，L-Trp修飾量為5．6 μg·mL-1， 其中 20～100 nm 的孔容為 0．244 cm3·g-1，僅為活化態(tài)時的40%(如表3所示)。所以使LCNTs/AC復合微球在吸附LDL時的有效孔容減少。

因此CNTs含量高時，雖然一方面修飾的配基密度增大，促進LDL吸附量的增加，但另一方面由于配基占據(jù)了一定的孔隙位置，使得有效孔容增長幅度降低，從而使得LDL的吸附量增長減緩。但總的趨勢仍是L-CNTs/AC復合微球?qū)DL的吸附能力隨著CNTs加入量的增大而增強。

圖9 修飾處理對40wt%CNTs/AC復合微球孔結(jié)構(gòu)的影響Fig．9 Effect of modification on the pores structure of 40wt%CNTs/ACcomposite beads

3 結(jié) 論

(1)環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法可將L-Trp修飾至CNTs/AC復合微球上。

(2)CNTs/AC復合微球中CNTs加入量越多，對LDL的吸附能力越強；當CNTs加入量為45wt%時，LDL吸附量達4．623 mg·g-1，是未添加碳納米管的2．3倍多。因此修飾了L-Trp的碳納米管基復合微球在作為血液灌流LDL吸附劑方面有較好的應用前景。

(3)CNTs在復合微球吸附LDL的過程中起到了重要的作用，一方面由于本身的堆積孔促進了復合微球內(nèi)中大孔的形成，構(gòu)建了通暢的LDL擴散通道；另一方面促進了配基在復合微球表面修飾量的增多，增強了復合微球與LDL之間的作用。

(4)在今后的研究中還需進一步考察此復合材料對高密度脂蛋白及血液相容性的影響。

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