于玥 鄔曉鷗 張高飛 陳森平

GC法測定沙棘籽油軟膠囊中亞油酸與α-亞麻酸的含量

于玥 鄔曉鷗 張高飛 陳森平

目的 建立一種同時檢測沙棘籽油軟膠囊中亞油酸、α-亞麻酸的方法。方法 采用INNOWAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)為分析柱, 柱溫200℃；進(jìn)樣口溫度220℃, 分流比50:1；FID檢測器溫度250℃；流速1.0 ml/min。樣品經(jīng)甲酯化后測定沙棘油軟膠囊中亞油酸與α-亞麻酸的含量。結(jié)果 亞油酸、α-亞麻酸與其他成分分離良好, 亞油酸在0.56～5.58 mg/ml范圍內(nèi)線性良好(r=0.9999), 高中低三濃度平均回收率99.8%～104.4%(n=2)；α-亞麻酸在0.48～4.80 mg/ml范圍內(nèi)線性良好(r=0.9998), 高中低三濃度平均回收率95.8% ～98.8%(n=2)。結(jié)論 本法簡便準(zhǔn)確, 重現(xiàn)性好, 易操作,可作為沙棘籽油軟膠囊的質(zhì)量控制方法。

亞油酸；α-亞麻酸；沙棘籽油；氣相色譜

沙棘系蒙古族、藏族習(xí)用藥材, 為胡頹子科植物沙棘(hippophae rhamnoidesL), 室溫干燥成熟果實(shí)［1］。沙棘油內(nèi)含有脂肪酸、烴類、萜類、維生素E、黃酮等有效組分和藥用成分, 對治療燒傷、皮膚輻射傷、胃及十二指腸潰瘍等疾病具有良好的療效［2,3］。目前沙棘籽油有效成分分析主要為維生素E［4,5］。為確保臨床療效, 采用氣相色譜法對沙棘籽油中有效成分亞油酸和α-亞麻酸同時進(jìn)行定量, 進(jìn)一步研究沙棘籽油軟膠囊合理質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

安捷倫7890A氣相色譜儀(配FID檢測器)；梅特勒XS105DU電子天平；亞油酸甲酯對照品(批號 BCBB1516；Fluka)；α-亞麻酸甲酯對照品(批號 U-62M-JA22-T；Nuchekprep, Inc)。48%三氟化硼乙醚為優(yōu)級純, 其余試劑均為分析純。

沙棘籽油軟膠囊由內(nèi)蒙古宇航人高技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為DB-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱(柱長30 m, 內(nèi)徑0.32, 膜厚度0.25 μm)；柱溫200℃；進(jìn)樣口220℃, 分流比50:1；FID檢測器250℃, 氫氣：空氣=30:300；載氣N2, 流速1 ml/min, 在該條件下, 亞油酸甲酯與α-亞麻酸甲酯峰形良好, 且與其他成分分離良好(圖1)。

圖1 沙棘籽油軟膠囊氣相色譜圖A. 對照品溶液 B.樣品溶液1. 亞油酸甲酯 2. α-亞麻酸甲酯

2.2 供試品溶液 精密稱取樣品內(nèi)容物0.2 g, 置10 ml具塞試管中, 精密加入正己烷2 ml, 再加入2 ml 0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液, 渦旋1 min, 靜置15 min, 加入飽和食鹽水5.0 ml,輕輕振搖, 靜置使分層, 吸取上清液1.00 ml, 置10 ml量瓶中,用正己烷定容至刻度, 搖勻, 即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取亞油酸甲酯對照品0.11157 g, α-亞麻酸甲酯對照品0.09599 g, 置10 ml量瓶中, 加正己烷溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 作為對照品貯備液。逐級精密稀釋至亞油酸甲酯濃度及α-亞麻酸甲酯濃度分別為5、4、2、1、0.5 mg/ml；精密吸取上述濃度對照品1μl, 注入氣相色譜儀,按2.1的方法測定, 以對照品的濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo), 測得的峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得亞油酸甲酯回歸方程y = 2077550.7753x-17244.5, r=0.9999；α-亞麻酸甲酯回歸方程：y=2073584.6095x-26385.2667, r=0.9998, 結(jié)果表明, 亞油酸甲酯對照品濃度在0.55785～5.5785 mg/ml之間、α-亞麻酸甲酯對照品濃度在0.47995～4.7995 mg/ml之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品(批號20100604)溶液, 自制備后, 按含量測定方法, 分別在0、1、3、4、5、6 h進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液自制備后6 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定(見表1)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號220100521)6份, 按

2.1 方法測定。結(jié)果重復(fù)性良好(見表2)。

2.6 加樣回收試驗(yàn) 取同一批樣品(批號20100521, 含亞油酸27.6%, α-亞麻酸18.4%)6份, 分別精密加入亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯對照品, 按2.1方法測定, 計算回收率。結(jié)果亞油酸甲酯低限平均回收率為99.8%；中間范圍平均回收率為103.9%, 高限平均回收率為102.8%；α-亞麻酸甲酯低限平均回收率為98.8%；中間范圍平均回收率為98.4%, 高限平均回收率為95.8%。

2.7 供試品的測定 取10批樣品, 按含量測定方法測定。結(jié)果, 見表3。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%)

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(%)

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

α-亞麻酸、亞油酸制劑含量測定的文獻(xiàn)報道很多, 基本全部采用了甲酯化的方法, 即經(jīng)過甲酯化反應(yīng)后, 測定其相應(yīng)的α-亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯的含量。

3.1 提取方式的選擇 甲酯化反應(yīng)大多采用先氫氧化鉀甲醇皂化之后三氟化硼溶液甲酯化的制備方法, 但亞麻酸、亞油酸在氫氧化鉀甲醇溶液中也可發(fā)生甲酯化反應(yīng), 故分別考察了上述兩種制備方法。結(jié)果表明, 兩種制備方法α-亞麻酸含量分別為18.8%、18.2%；亞油酸含量分別為27.7%、27.2%, 兩者無顯著差異。但由于三氟化硼有毒, 并且從操作的簡便性考慮, 選擇氫氧化鉀甲醇溶液直接甲酯化的方法。

3.2 提取溶劑的選擇 分別使用正己烷、正辛烷、石油醚Ⅰ、石油醚Ⅱ、正己烷-石油醚Ⅰ(1：1)及乙醚為提取溶劑, 使用正辛烷為提取溶劑時, 樣品中亞油酸、α-亞麻酸的含量明顯低于其他溶劑；而乙醚及石油醚Ⅰ的結(jié)果雖然較高, 但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn), 精密加入2 ml溶劑提取, 加入飽和食鹽水后, 再次分層出來的上清液體積＜2 ml, 導(dǎo)致供試品溶液濃度偏高, 產(chǎn)生供試品含量高的假象。綜合結(jié)果及實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象考慮, 最終選擇正己烷作為提取溶劑。

3.3 氫氧化鉀濃度的選擇 分別選擇0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液作為甲酯化溶液, 結(jié)果供試品中亞油酸含量分別為：24.4%、25.6%、23.9%；α-亞麻酸含量分別為：16.7%、17.5%、16.4%。表明氫氧化鉀的濃度對結(jié)果的影響不大, 選用0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇作為甲酯化溶劑。

3.4 甲酯化時間的選擇 精密稱取供試品(批號20100521) 0.2 g, 按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行制備供試品, 渦旋后, 分別靜置5 min, 10 min, 15 min, 20 min后測定。靜置15 min后, 反應(yīng)才基本進(jìn)行完全, 故甲酯化時間選擇為15 min。

3.5 洗滌溶劑的選擇 在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn), 若不加水相, 提取的有機(jī)溶劑會有部分與氫氧化鉀甲醇互溶, 導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確；加入蒸餾水振搖洗滌后, 易乳化, 不能迅速分層。參考同類文獻(xiàn), 將蒸餾水改為飽和食鹽水后, 振搖能夠迅速分層,且能避免提取的有機(jī)溶劑與氫氧化鉀甲醇互溶現(xiàn)象。

［1］ 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典, 2010年版一部.北京, 國家藥典委員會.

［2］ 吳大偉,張建華,王雪平.超臨界萃取沙棘油的研究.遼寧化工, 2006, 35(2):77-79.

［3］ 安俊龍,安利俊,劉均洪.沙棘油中有限成分和藥用成分的研究.化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù), 2004,25(3):1-3.

［4］ 李彤輝,李林,蔣楠.沙棘籽油中維生素E的含量測定方法研究.陜西中醫(yī), 2012,33(7):898-899.

［5］ 姚倩,劉碧崇,費(fèi)洪新.C測定沙棘油中的α-生育酚.沙棘, 2009, 22(2):6-7.

518057 深圳市藥品檢驗(yàn)所