杜利月，郭留城

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 漯河 462002)

鬼針草為菊科(Composite)鬼針草屬 Bidens Pilosa L.植物，有230余種，分布于熱帶及溫帶地區(qū)，主產(chǎn)于美洲，具有廣泛的生物活性，有抗瘧、抑菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血壓、保肝、抗?jié)兊裙π?，且毒性極低[1－3]。為更有效地開(kāi)發(fā)和利用藥材資源，充分提取鬼針草中所含的總黃酮成分，筆者采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲波提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用鬼針草提供參考。

1 儀器與試藥

KQ500DE型醫(yī)用超聲波(昆山市超聲儀器有限公司);Carry100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安);RE3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。女貞子(藥用，漯河市廣惠和醫(yī)藥有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 生藥蘆丁含量測(cè)定

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇:精密稱(chēng)取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品1.6 mg，以甲醇定容至 10 mL，即得 160μg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液3.5 mL，用甲醇稀釋至25 mL，即得22.4μg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。以甲醇為空白，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果蘆丁在257 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:分別精密量取 0.5，2，3.5，5，6.5，8mL 的蘆丁對(duì)照品貯備液，并分別加甲醇至10mL，搖勻后在257 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，以取樣量(X)為橫坐標(biāo)，樣品吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，得線(xiàn)性方程 Y=0.059 5X+0.004 1，r=0.999 3。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在8～128μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

總黃酮含量測(cè)定:以蘆丁對(duì)照品為標(biāo)樣測(cè)定鬼針草提取液中總黃酮含量。分別準(zhǔn)確量取提取樣品1.0mL置50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后于257 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定，以甲醇為空白對(duì)照。

回收率試驗(yàn):精密量取上述已知含量的鬼針草提取液，準(zhǔn)確加入蘆丁對(duì)照品 1.00mg，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定，得蘆丁的回收率為99.3%。

2.2 單因素試驗(yàn)

溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%)、溶劑用量(8倍)、提取時(shí)間(30min)和提取次數(shù)(3次)4個(gè)因素中選取任意一個(gè)因素的5個(gè)水平，固定另外3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將提取液濃縮，用甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，搖勻后，按照2.1項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定含量，并計(jì)算鬼針草中總黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)低時(shí)，總黃酮的含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)高時(shí)，總黃酮的含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。故選取50%乙醇作為溶劑?？傸S酮的含量隨溶劑用量的增加而增加，但溶劑超過(guò)6倍用量時(shí)，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢?？傸S酮的含量隨提取時(shí)間的增加而增加，提取時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢。總黃酮的含量隨提取次數(shù)的增加而增加，且提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取溶劑中提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、溶劑用量(C)和溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為考察因素[4－5]，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平。結(jié)果見(jiàn)表2。按照 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，超聲提取，將提取液濃縮，用甲醇稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，搖勻后，按照2.1項(xiàng)下方法測(cè)定含量，計(jì)算鬼針草中總黃酮的含量，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。結(jié)果表明，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響因素由大到小的順序是提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞溶劑用量＞溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)，其中提取時(shí)間對(duì)結(jié)果有顯著性影響。由方差分析結(jié)果可確定最佳超聲提取條件為A3B2C1D2，即以50%乙醇為溶劑，加6倍溶劑，超聲提取3次，每次提取50min。

2.4 提取工藝驗(yàn)證

為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，測(cè)得鬼針草總黃酮的含量分別為9.81‰，9.87‰，9.84‰，平均 9.84‰，RSD 為 0.3% 。測(cè)定結(jié)果均等于或優(yōu)于正交試驗(yàn)表中的任何一組，重現(xiàn)性好，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析表

3 討論

鬼針草始載于《本草拾遺》，以干燥的全草入藥，味苦、性平、無(wú)毒，具有清熱解毒，活血、散瘀、消腫之功效，其活性成分以黃酮類(lèi)為主[6]。鬼針草中蘆丁等黃酮類(lèi)化合物因分子中有桂皮酰基及苯甲?；M成的交叉共軛體系，具有相同的吸光度測(cè)試性質(zhì)，均在257 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選定在257 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。在正交試驗(yàn)中，從總黃酮這一指標(biāo)來(lái)看，因素A的影響最大，差異性最顯著，所以選擇提取時(shí)間為50 min。本試驗(yàn)優(yōu)選出的工藝簡(jiǎn)單，操作控制容易，穩(wěn)定性好，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Chang SL，Chang CL，Chiang YM，etal.Polyacetylenic compounds and butanol fraction from Bidens pilosa canmodulate the differentiation of helper T cells and preventautoimmune diabetes in non－obese diabeticmice[J].Planta Med，2004，70(11):1 045 － 1 051.

[2]Atta AH，Mouneir SM.Evaluation of somemedicinal plant extracts for anti diarrhoealactivity[J].Phytother Res，2005，19(6):481 － 485.

[3]夏 勤.鬼針草腸溶膠囊急性毒性實(shí)驗(yàn)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(9):2 206.

[4]王小華，鄧 斌，張曉軍，等.紅薯葉黃酮類(lèi)化合物提取及其抗氧化作用研究[J].糧食與油脂，2008(12):26－28.

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[6]趙 燕，趙 瑩，王緒成.鬼針草的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18(15):1 189－1 190.