盧倩 弭曉菊 崔繼哲

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDHs）是所有生物中高度保守的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的碳代謝中起著核心作用，是維持生命活動(dòng)能量形成的最基本酶之一。長(zhǎng)期以來(lái)，普遍認(rèn)為這個(gè)基因及其蛋白的功能是有限的，它一直被作為“持家”基因，用于研究目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)的內(nèi)對(duì)照［1］；它也被認(rèn)為是一個(gè)經(jīng)典的模式蛋白，常被用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析和酶催化機(jī)理的研究中。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，GAPDHs是一個(gè)多功能的酶，參與細(xì)胞內(nèi)膜分揀、受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等事件，在許多細(xì)胞路徑中起關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物中GAPDH的基因結(jié)構(gòu)、生化機(jī)理及其功能特性等已有比較深入的了解［2］，植物中GAPDH的作用及其機(jī)制也不斷被揭示。本文概述有關(guān)的研究進(jìn)展，以期為植物GAPDH的深入研究提供參考。

1 GAPDH的類型

高等植物中GAPDH是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其催化的相關(guān)反應(yīng)如圖1所示［3，4］。高等植物中的GAPDH可分為磷酸化和非磷酸化兩大類。

磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，因其細(xì)胞學(xué)定位的不同分為GAPC、GAPCp 和GAPA/B 三類同工型。GAPC是細(xì)胞質(zhì)中的GAPDH（EC 1.2.1.12），特異地以NAD+（H）為輔酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反應(yīng)，這是糖酵解（糖異生）中唯一的氧化（還原）反應(yīng)［5］。擬南芥中有2個(gè)GAPC，GAPC1和GAPC2的氨基酸序列一致性高達(dá)98％，都由4個(gè)相同亞基組成，有高度的結(jié)構(gòu)相似性［6］。擬南芥、煙草中GAPCs的cDNA序列可能具有生態(tài)型的特異性［7］。

GAPCp和GAPA/B都是質(zhì)體型GAPDH，但GAPCp主要定位于非綠色質(zhì)體中，依賴于NAD+，通過(guò)該酶和磷酸甘油酸激酶（PGK）催化的兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)，形成3-磷酸甘油酸和ATP。擬南芥中GAPCp1和GAPCp2氨基酸序列的一致性為93％，N端有質(zhì)體定位信號(hào)，葉片中定位于葉綠體和非綠質(zhì)體中，根中定位于非綠質(zhì)體［8］。

GAPA/B是葉綠體中的GAPDH（EC 1.2.1.13），多以NADPH（有的也以NADH）為輔酶，催化糖酵解的逆反應(yīng)，將1，3-二磷酸甘油酸還原為甘油醛-3-磷酸，該酶在同化CO2的卡爾文循環(huán)中起中心作用［9］。高等植物葉綠體GAPDH有GapA和GapB兩種亞基，GapA和GapB亞基的一致性為80％［10］，但GapA缺少GapB的C末端可調(diào)控區(qū)。GapB的這個(gè)可調(diào)控區(qū)由30個(gè)氨基酸殘基組成，含有2個(gè)硫氧還蛋白作用的Cys［9，11］。由GapA和GapB組成的異四聚體A2B2是GAPDH的主要活性形式［12］。此外，還有A4和

非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，表示為NPGAPDH或GAPN（EC 1.2.1.9），定位于胞質(zhì)中，被認(rèn)為是催化糖酵解“旁路”反應(yīng)的酶，其催化依賴于NADP+的將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸［13］，同時(shí)伴有NADPH生成的不可逆反應(yīng)（圖1）。NP-GAPDH是醛脫氫酶（ALDH）超家族中的一員，最新的研究將其歸為ALDH11家族［14］，該酶與磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶在基因與蛋白序列上并沒(méi)有同源性。

圖1 植物細(xì)胞糖酵解及卡爾文循環(huán)中不同同工型GAPDH的作用［3，4］

2 GAPDH的作用

擬南芥的GAPC1在維持細(xì)胞ATP水平、保持植株育性中起關(guān)鍵作用。對(duì)GAPC1缺失和反義突變體的研究發(fā)現(xiàn)二者葉和根基本正常，但植株生長(zhǎng)延緩、果實(shí)形狀改變、種子數(shù)減少、育性降低，gapc1中ATP水平和呼吸率降低顯示，GAPC1的缺失導(dǎo)致糖酵解和三羧酸循環(huán)中間物發(fā)生改變，影響了碳源的流向和線粒體中氧化磷酸化作用，進(jìn)而影響了主要通過(guò)呼吸作用提供能量的生殖器官的發(fā)育［6］。

擬南芥中的兩個(gè)GAPCp功能冗余，活性低于胞液中的同工型。但是，GAPCp通過(guò)影響根中Ser的合成和供應(yīng)，在植物發(fā)育過(guò)程中起重要作用［3］。gapcp雙突變體嚴(yán)重矮化，根系短小，植株不育。其機(jī)制在于GAPCp的失活，影響了糖酵解路徑中通過(guò)該酶和磷酸甘油酸激酶（PGK）催化的3-磷酸甘油酸的形成。而Ser的體內(nèi)合成是在質(zhì)體中以3-磷酸甘油酸為前體進(jìn)行的（圖1），在 gapcp雙突變體根中由于3-磷酸甘油酸的不足致使Ser 合成受阻，進(jìn)而可能導(dǎo)致鞘脂合成受抑制，細(xì)胞變小而致植株矮化［8］。研究證明，根中GAPCp的主要功能是提供絲氨酸合成所必需的3-磷酸甘油酸［3］?？梢?jiàn)，糖酵解質(zhì)體路徑在代謝中的重要性和代謝路徑區(qū)室化的必要性。

胞質(zhì)中催化糖酵解“旁路”反應(yīng)的NP-GAPDH，直接將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時(shí)生成的是NADPH，而不是NADH和ATP。該酶催化的反應(yīng)具有重要的意義，其一為機(jī)體合成代謝提供還原力NADPH，維持胞質(zhì)中NADPH的水平；二是保證逆境條件下碳源流的通暢。許多植物中甘露醇等合成所需的NADPH主要來(lái)源于該反應(yīng)［14］；在磷饑餓或ADP水平低下而無(wú)法合成ATP時(shí)，NPGAPDH上調(diào)表達(dá)，而包括GAPC1在內(nèi)的其他基因則被下調(diào)。通過(guò)NP-GAPDH的作用，可以使碳源順利流經(jīng)糖酵解途徑［6］。

NP-GAPDH缺失誘使胞液GAPDH表達(dá)提高，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）的mRNA含量和酶活性也提高，但編碼糖酵解和光合作用中的幾個(gè)其他酶的基因下調(diào)，由此選擇性封阻了糖酵解路徑，使更多的葡萄糖-6-磷酸通過(guò)磷酸戊糖途徑的G6PDH作用產(chǎn)生NADPH，這對(duì)于保持細(xì)胞中NADPH水平具有重要意義［15］。

3 GAPDH與NAD（P）互作的特異性

GAPDH屬于結(jié)合酶，需要NAD或NADP輔酶的參與才有活性。NADP比NAD僅多一個(gè)磷酸基團(tuán)，但這兩個(gè)輔酶與GAPDH的作用不同，胞質(zhì)GAPDH的酶活特異性地依賴于NAD，而葉綠體GAPDH對(duì)NADP親和性更強(qiáng)。Tien等［10］首次分析了水稻胞質(zhì)OsGAPDH晶體結(jié)構(gòu)，并通過(guò)對(duì)菠菜葉綠體GAPDH（SoGAPDH）晶體結(jié)構(gòu)［16］的比較研究，提出了高等植物中GAPDH與NAD或NADP特異性互作的機(jī)制。

水稻胞質(zhì)GAPDH（OsGAPDH）是由4個(gè)單體組成的同源四聚體，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：NAD結(jié)合域、催化域和一個(gè)S-loop。OsGAPDH只與NAD互作，主要是因?yàn)閹讉€(gè)關(guān)鍵基團(tuán)不同于葉綠體中的SoGAPDH，其中在S-loop處，OsGAPDH比SoGAPDH多出一個(gè)外突的Phe37，其苯環(huán)成為NADP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)的障礙。而Phe37是OsGAPDH穩(wěn)定結(jié)合NAD 的關(guān)鍵，Phe37突變體顯著影響了OsGAPDH的催化效率和對(duì)NAD的親和性。同時(shí)，Asp35和Pro193也是OsGAPDH特異性結(jié)合NAD的必需基團(tuán)。

菠菜葉綠體GADPH（SoGAPDH）為同源四聚體A4。OsGAPDH 和SoGAPDH的氨基酸序列一致性僅為47％，但二者的整體結(jié)構(gòu)相似，它們與NAD或NADP主要都是通過(guò)氫鍵結(jié)合，但SoGAPDH一個(gè)單體中的Thr33和另一個(gè)相鄰單體的Ser188能與NADP多出的磷酸基團(tuán)上的氧原子形成2個(gè)氫鍵，因此SoGAPDH對(duì) NADP有更大的親和性［10］。

葉綠體A2B2型GAPDH通過(guò)GapB的C端兩個(gè)Cys之間的二硫鍵調(diào)節(jié)著酶活。黑暗條件下，Cys殘基間形成二硫鍵，誘導(dǎo)C端構(gòu)型改變，導(dǎo)致GapB的Glu362與S-loop互作，由此可阻止NADPH進(jìn)入酶的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低GAPDH活性。光照條件下，還原型硫氧還蛋白破壞二硫鍵，產(chǎn)生了有利于NADPH進(jìn)入酶活性位點(diǎn)的構(gòu)型，使酶激活，而以NADH為輔酶時(shí)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)作用［11］。黑暗條件下，NADPH下調(diào)GAPDH的活性，可能的意義在于降低或關(guān)閉卡爾文循環(huán)，將NADPH作為還原力用于脂肪酸合成和氮還原。NADPH對(duì)GAPDH活性的調(diào)控可能是暗-光轉(zhuǎn)化下GAPDH活性調(diào)控的一種方式，但這是蛋白-蛋白互作的直接還是間接效應(yīng)尚需試驗(yàn)確定［9］。

4 PRK/GAPDH/CP12復(fù)合體及其調(diào)節(jié)

卡爾文循環(huán)受光調(diào)節(jié)。光通過(guò)光反應(yīng)改變?nèi)~綠體的內(nèi)環(huán)境，間接地影響著酶的活性，光可激活GAPDH、磷酸核酮糖激酶（PRK）等參與卡爾文循環(huán)的酶，在黑暗中這些酶則被鈍化。

GAPDH和PRK通過(guò)與葉綠體內(nèi)在蛋白CP12形成可逆的PRK/GAPDH/CP12多酶復(fù)合體協(xié)同調(diào)控卡爾文循環(huán)［12］。CP12首先通過(guò)C端與GAPDH結(jié)合成GAPDH-CP12復(fù)合體，而后通過(guò)CP12的N端結(jié)合PRK而形成超分子復(fù)合體，復(fù)合體中PRK和GAPDH處于失活狀態(tài)。形成復(fù)合體時(shí)，CP12的C末端插入到GAPDH活性位點(diǎn)區(qū)，與GAPDH上底物的幾個(gè)結(jié)合基團(tuán)互作，完全覆蓋了底物的結(jié)合位點(diǎn)，由此導(dǎo)致對(duì)GAPDH的競(jìng)爭(zhēng)性抑制［17］。GAPDHCP12復(fù)合體形成后，CP12發(fā)生部分折疊，在其表面形成負(fù)電荷區(qū)，通過(guò)靜電作用，使PRK與之N端結(jié)合［17］。光照下葉綠體基質(zhì)中NADP（H）/NAD（H）升高，促使GAPDH-CP12解離，激活GAPDH；而黑暗下 NADP（H）/NAD（H）降低，激活GAPDHCP12復(fù)合體，使GAPDH失活。

較早的研究認(rèn)為，由于GapA缺少GapB中C末端的可調(diào)控區(qū)，僅A4型GAPDH以PRK/GAPDH/CP12復(fù)合體調(diào)控酶活［18］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH的兩種四聚體形式 A4和 A2B2都能參與PRK/GAPDH/CP12復(fù)合體的形成，PRK/GAPDH/CP12復(fù)合體的作用并不僅僅是調(diào)控“不可調(diào)節(jié)”的A4型GAPDH。PRK/GAPDH/CP12的豐度和性質(zhì)在不同的物種中不同，不同物種的CP12狀態(tài)、與其結(jié)合的PRK和 GAPDH的數(shù)目、亞基組成也不同。因此，不同物種對(duì)PRK和 GAPDH的調(diào)節(jié)有很大的不同［12］。

5 逆境脅迫下GAPDH 的應(yīng)答及機(jī)理

在澇害所致低氧、氧化、熱激、傷害等脅迫條件下，植物GAPDH表現(xiàn)出不同的脅迫響應(yīng)，對(duì)此已有較多的研究，王幼寧等［19］、梁穎等［20］對(duì)較早的工作已進(jìn)行比較系統(tǒng)的綜述。近期的研究明確，綠藻（D. bardawil）葉綠體DbGAPDH的啟動(dòng)子區(qū)有氧應(yīng)答元件、光調(diào)節(jié)元件、冷脅迫調(diào)控元件等6個(gè)明顯的調(diào)控元件，也預(yù)示DbGAPDH調(diào)控的復(fù)雜性及其功能的多樣性［5］。黃瓜受到澇脅迫危害時(shí)，CsGAPDH在根中快速響應(yīng)并且高表達(dá)［21］。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下羊草GAPDH在灰綠型和黃綠型兩種生態(tài)型中的表達(dá)隨NaCl脅迫濃度的不同差異顯著。各種生物或非生物的逆境脅迫過(guò)程都會(huì)產(chǎn)生氧化脅迫，GAPDH在植物抗氧化脅迫和應(yīng)答氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。gapc1、np-gapdh中氧化脅迫增強(qiáng)，體內(nèi)ROS水平升高［6］；過(guò)表達(dá)OsGAPC3的水稻植株中，OsGAPC3通過(guò)提高過(guò)氧化氫酶（CAT）控制了逆境下H2O2的過(guò)高累積，避免了鹽脅迫下ROS對(duì)細(xì)胞的傷害，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性提高［22］。擬南芥中，H2O2通過(guò)氧化GAPC1催化位點(diǎn)的Cys，促進(jìn)GAPC1與質(zhì)膜上的磷脂酶PLDδ互作，提高了PLDδ的活性，其以磷脂酰乙醇胺為底物生成磷脂酸PA［23］，H2O2激活GAPC與PLDδ的互作，可能建立起了在植物應(yīng)答ROS和水脅迫過(guò)程中膜質(zhì)信號(hào)與能量代謝和生長(zhǎng)調(diào)控之間的直接聯(lián)系［23］。

從目前的研究看，GAPDH的谷胱甘肽化及其巰基的亞硝基化是GAPDH在植物抗氧化脅迫和應(yīng)答氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用的一種重要機(jī)制。

蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化（S-glutathionylation）是一種可逆的特異修飾，是指蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基和谷胱甘肽（GSH）形成混合型二硫鍵。去谷胱甘肽化由體內(nèi)的巰基-二硫鍵氧化還原酶，如谷氧還蛋白Grx、硫氧還蛋白Trx、小分子氧化還原蛋白Srx等催化［24］。GAPDH的催化亞基Cys能被H2O2氧化，致使GAPDH完全或部分地失活［23］。擬南芥GAPC1的活性嚴(yán)格依賴于催化亞基Cys149［4］，Cys149對(duì)H2O2極為敏感，H2O2使Cys149的-S-不可逆地氧化為-SO2-和-SO3-。還原型的谷胱甘肽GSH能夠使GAPC1谷胱甘肽化，形成Cys149-SSG，從而避免上述不可逆的氧化過(guò)程［4］。通過(guò)谷胱甘肽化GAPC1，可使糖酵解途徑的反應(yīng)下調(diào)，從而增加葡萄糖通過(guò)磷酸戊糖途徑的氧化而產(chǎn)生合成更多的抗氧化酶所需的NADPH。在植物胞質(zhì)中GR和NTR是主要的抗氧化酶。以NADPH為電子供體，Grx通過(guò)胞漿的谷氧還原酶提供還原劑（GSH）可有效的使GAPC1去谷胱甘肽化。另外，還可以通過(guò)涉及NADPH、NTR和胞質(zhì)Trxh的系統(tǒng)去谷胱甘肽化，GAPC1被再激活（圖1）。GAPN對(duì)H2O2則表現(xiàn)為抗性，在氧化脅迫下，小麥和玉米的幼苗中GAPN活性提高兩倍，通過(guò)旁路反應(yīng)形成NADPH，保證有充足的NADPH為抗氧化酶供應(yīng)。總之，在脅迫條件下，植物細(xì)胞可以通過(guò)對(duì)關(guān)鍵酶活性的調(diào)解，重定向主要代謝路徑，不僅強(qiáng)化了植物抗氧化系統(tǒng)，并且通過(guò)如使谷胱甘肽化的GAPC1被再激活等為植物恢復(fù)創(chuàng)造條件。

葉綠體中GAPDH的同工型A4也可被H2O2氧化和谷胱甘肽化，擬南芥A4-GAPDH的Cys149經(jīng)谷胱甘肽化可避免脅迫造成的不可逆轉(zhuǎn)的氧化。參與光合作用的GAPDH主要同工型 A2B2或A8B8也對(duì)氧化劑敏感，但似乎并不被明顯地谷胱甘肽化［4］。GAPDH的谷胱甘肽化可能是脅迫下避免其不可逆氧化的調(diào)節(jié)和保護(hù)的一種重要機(jī)制［7］。

蛋白質(zhì)巰基的亞硝基化（S-nitrosylation）是指NO及其衍生物與蛋白質(zhì)Cys的巰基-SH作用生成-SNO［25］。S-亞硝基化修飾與磷酸化修飾類似，通過(guò)改變蛋白質(zhì)空間構(gòu)象修飾其活性［26］。擬南芥中，NO使GAPC的活性位點(diǎn)的Cys基團(tuán)S-亞硝基化，抑制GAPDH的活性，DTT能使酶活得以恢復(fù)［27］；在病原入侵的超敏反應(yīng)中GAPDH也會(huì)發(fā)生S-亞硝基化修飾［28］。鹽脅迫下，煙草BY-2細(xì)胞中GAPDH與SnRK2蛋白激酶NtOSAK直接互作，但GAPDH并不被NtOSAK磷酸化，而是受NO作用被S-亞硝基化。S-亞硝基化的GAPDH不影響NtOSAKGAPDH復(fù)合體的形成，也不影響NtOSAK蛋白激酶的活性，但不排除GAPDH與NtOSAK信號(hào)路徑中其他分子的互作［7］，GAPDH可能參與了包括磷酸化事件在內(nèi)的植物信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［7，29］。

擬南芥、菠菜胞液中GAPDH的 S-亞硝基化修飾都發(fā)生在酶活性位點(diǎn)的Cys上。GAPDH同時(shí)受NO和H2O2的調(diào)控，表明GAPDH很可能是這兩個(gè)信號(hào)分子調(diào)控途徑的交匯點(diǎn)之一，揭示這些交聯(lián)對(duì)話的重要性將是未來(lái)深入研究面臨的主要挑戰(zhàn)。

綜上所述，近年在植物GAPDH多樣性作用機(jī)理方面的研究取得了較大進(jìn)展，但哺乳動(dòng)物中GAPDH通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA互作、蛋白質(zhì)-RNA互作和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程展示的多功能性［5］和擬南芥磷脂酸PA與GAPC特異性互作發(fā)現(xiàn)［30］，GAPDH的許多功能并不需要其糖酵解的活性，植物中GAPDH很可能與哺乳動(dòng)物采用相似的方式調(diào)控著細(xì)胞中基因的表達(dá)。在植物細(xì)胞中GAPDH這類參與經(jīng)典代謝酶的如何進(jìn)入細(xì)胞核與DNA互作，如何在細(xì)胞之中與其他蛋白、脂質(zhì)等互作影響相關(guān)基因mRNA的穩(wěn)定性而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)，值得特別關(guān)注和展開(kāi)深入研究。

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