陳 文 李 蕾 陳國千

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫 214023

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其絕大多數(shù)為移行細(xì)胞癌。膀胱癌目前以手術(shù)治療為主，但五年生存率低。慢性感染和炎癥被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展極為重要的原因之一。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，可以分泌到胞外并介導(dǎo)炎性反應(yīng)，是一種重要的晚期促炎癥因子[1]。研究顯示，HMGB1的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后等關(guān)系密切[2]。最近研究表明，HMGB1在膀胱癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的分級、分期及患者預(yù)后相關(guān)[3-4]。脂多糖（LPS）可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等主動釋放HMGB1到胞外[5-6]。LPS對膀胱癌細(xì)胞誘導(dǎo)HMGB1釋放作用尚未見研究報道，本研究旨在觀察LPS對膀胱癌細(xì)胞釋放HMGB1的影響，并探討其相關(guān)信號通路機(jī)制，為闡明疾病治療新途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)液、OPTI-MEM I培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；LPS、LY294002 購自美國 Sigma公司，HMGB1 ELISA試劑盒購自日本Shino-Test公司；Trizol、 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。HMGB1、GAPDH引物由日本TaKaRa公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，將人膀胱癌細(xì)胞株T24置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時，換用無血清OPTI-MEM I培養(yǎng)液。首先經(jīng)預(yù)實驗篩選出LPS的合適濃度和LY294002的不同濃度及檢測培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的最佳時間。選擇100 μg/L LPS為作用濃度。只加OPTI-MEM I培養(yǎng)液組為對照組，加含100 μg/L LPS培養(yǎng)液組為LPS誘導(dǎo)組，并于LPS誘導(dǎo)6、12、18、24 h檢測培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度和細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)水平。加100 μg/L LPS及不同濃度LY294002組為LY294002干預(yù)組，LY294002預(yù)處理時于100 μg/L LPS誘導(dǎo)前1 h加入培養(yǎng)細(xì)胞，干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，然后離心取上清液檢測HMGB1含量。每組實驗均重復(fù)3次。

1.3 HMGB1濃度測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度。按試劑盒說明書進(jìn)行實驗。

1.4 HMGB1 mRNA測定

根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計測定其濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HMGB1上游引物：TTGTCGGGAGGAGCATAA，下游引物：GGGCGATACTCAGAGCAGAA，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為267 bp。內(nèi)參為3-磷酸甘油醛脫氫酶 （GAPDH），上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG，下游引物：GGAAGATGGTGATGGGATT，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為208 bp。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s，循環(huán)40次。以目的基因HMGB1和內(nèi)參GAPDH的Ct值之差（△Ct）作為評價目的基因mRNA相對表達(dá)水平的指標(biāo)。目的基因mRNA的相對量按公式：目的基因=2-△△Ct計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對膀胱癌細(xì)胞HMGB1釋放的影響

膀胱癌細(xì)胞T24經(jīng)100 μg/L LPS誘導(dǎo)12、18、24 h后，培養(yǎng)上清液中HMGB1含量均高于各自對照組（P＜0.05或 P＜0.01），分別為對照組的 1.9、3.5、4.2 倍，見表1。

表1 不同細(xì)胞培養(yǎng)時間下脂多糖對膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1 含量的影響（μg/L，±s，n=3）

表1 不同細(xì)胞培養(yǎng)時間下脂多糖對膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1 含量的影響（μg/L，±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

對照組LPS誘導(dǎo)組2.77±0.41 2.67±0.57 2.87±0.52 5.31±0.90*組別 6 h 12 h 3.07±0.57 10.79±1.19**4.22±0.46 17.56±2.47**18 h 24 h

2.2 LPS對膀胱癌細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)的影響

膀胱癌細(xì)胞 T24 經(jīng) 100 μg/L LPS 誘導(dǎo) 12、18、24 h后，細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)水平均高于各自對照組（P＜0.05或 P＜0.01），分別為對照組的 2.2、2.3、3.2倍。見表2。

2.3 PI3K/AKT信號通路抑制劑對LPS誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞HMGB1釋放的抑制作用

PI3K/AKT信號通路抑制劑20、40μmol/L LY294002對LPS誘導(dǎo)24 h的膀胱癌細(xì)胞T24釋放HMGB1均顯示明顯的抑制作用（P＜0.01）。40 μmol/L 的 LY294002抑制作用強(qiáng)于 20 μmol/L（P＜0.05）。10 μmol/L的LY294002對LPS誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞釋放HMGB1未起抑制作用（P＞0.05）。見圖1。

表2 不同細(xì)胞培養(yǎng)時間下脂多糖對膀胱癌細(xì)胞高遷移率族蛋白B1 mRNA 表達(dá)的影響（△Ct，±s，n=3）

表2 不同細(xì)胞培養(yǎng)時間下脂多糖對膀胱癌細(xì)胞高遷移率族蛋白B1 mRNA 表達(dá)的影響（△Ct，±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

對照組LPS誘導(dǎo)組4.29±0.56 3.97±0.49 4.56±0.57 3.41±0.37*組別 6 h 12 h 4.28±0.46 3.08±0.32*4.30±0.45 2.60±0.35**18 h 24 h

圖1 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路抑制劑對脂多糖誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞釋放HMGB1的影響（n=3）

3 討論

HMGB1是普遍存在于真核細(xì)胞核內(nèi)重要的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而被命名。HMGB1過去被認(rèn)為是染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，功能局限在核內(nèi)，主要參與穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA復(fù)制及調(diào)節(jié)類固醇激素等活動。1999年，Wang等[1]首次發(fā)現(xiàn)HMGB1可以介導(dǎo)炎性反應(yīng)，是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)。

HMGB1可以在細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、LPS等因素刺激下，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等主動分泌；也可由壞死細(xì)胞或受損細(xì)胞被動釋放。HMGB1參與許多疾病的病理過程，如膿毒癥、腫瘤等[2,7]。研究表明，HMGB1在肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等人類惡性腫瘤中呈高表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展及患者預(yù)后等相關(guān)[2]。HMGB1在膀胱癌中的研究極少，最新研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在膀胱癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的分級、分期及患者預(yù)后有關(guān)[3]。但HMGB1在膀胱癌中的具體分子作用機(jī)制尚未見研究報道。

本研究以LPS作為刺激因素，探討其對膀胱癌細(xì)胞T24 HMGB1釋放的影響。應(yīng)用臺盼藍(lán)染色法檢測到100 μg/L LPS誘導(dǎo)24 h后，各組膀胱癌細(xì)胞存活率均在95%以上，因而排除了細(xì)胞通過壞死損傷發(fā)生的HMGBl被動釋放。本研究顯示，膀胱癌細(xì)胞經(jīng)缺氧誘導(dǎo)12 h后，培養(yǎng)上清液中HMGB1蛋白含量較常氧對照組升高，并呈時間依賴性，24 h達(dá)到峰值。本研究亦測定了細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)水平，實驗結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)12 h時細(xì)胞HMGB1基因水平已顯示增高，提示LPS誘導(dǎo)的HMGB1釋放增加受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能[8-11]。有研究顯示，PI3K/AKT通路活性改變與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002進(jìn)行細(xì)胞實驗，結(jié)果顯示干預(yù)LY294002對LPS誘導(dǎo)24 h的膀胱癌細(xì)胞釋放HMGB1具有抑制作用。40 μmol/L 的 LY294002抑制作用強(qiáng)于 20 μmol/L。10 μmol/L的LY294002對LPS誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞釋放HMGB1沒有影響。提示胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路參與LPS誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞HMGB1的釋放，可為膀胱癌的臨床治療提供新的靶點和策略，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的研究方向。HMGB1介導(dǎo)炎性反應(yīng)還可能涉及其他途徑及細(xì)胞因子的作用，Chen等[5]研究表明，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞HMGB1釋放與CD14、TNF依賴途徑有關(guān)；楊嵐等[12]報道LPS誘導(dǎo)肥大細(xì)胞HMGB1釋放涉及MAPK通路。LPS誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞HMGB1釋放是否還涉及其他信號通路有待深入研究。

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