韓 磊 李鳴皋 葉 平

1.海軍總醫(yī)院全軍航海航空醫(yī)學(xué)中心，北京 100048；2.解放軍總醫(yī)院老年心血管二科，北京 100853

隨著老年人口的逐漸增加，老齡化及其帶來(lái)的老齡人口的健康問(wèn)題正日益成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的主要問(wèn)題之一，正確認(rèn)識(shí)衰老發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程進(jìn)而揭示其分子機(jī)制，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。本研究以老年大鼠為研究對(duì)象，觀察老年大鼠心肌丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脂褐素、衰老特異性β半乳糖苷酶等衰老相關(guān)指標(biāo)的變化及阿托伐他汀干預(yù)對(duì)上述因素的影響。進(jìn)而為研究衰老的病理機(jī)制和防護(hù)措施探索新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和設(shè)備

Wistar大鼠（北京維通利華公司），阿托伐他?。ù筮B輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：75837005），衰老特異性β半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），脂褐素檢測(cè)試劑盒 （南京建成生物工程研究所），MDA檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），臺(tái)式高速離心機(jī) （Sigma公司），高速冷凍離心機(jī)（Heraeus Labofuge 400），冰凍切片機(jī)（Leica CM1850），水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司），熒光分光光度計(jì)（日本島津RF-5301PC）。

1.2 動(dòng)物模型建立

購(gòu)買10個(gè)月齡的Wistar大鼠90只（北京維通利華公司），雌雄各半，飼養(yǎng)10～20個(gè)月齡。將大鼠隨機(jī)分成3個(gè)組，每組30只，分別為老年對(duì)照組、大劑量和小劑量阿托伐他汀組。大、小劑量阿托伐他汀組分別給予阿托伐他汀[10 mg/（kg·d）、1 mg/（kg·d）]灌胃，老年對(duì)照組大鼠灌喂等量的 0.9%氯化鈉溶液。每周定時(shí)對(duì)大鼠稱重，依據(jù)體重情況確定阿托伐他汀的劑量。灌胃4個(gè)月后，老年對(duì)照組存活大鼠27只，小劑量阿托伐他汀組存活24只，大劑量阿托伐他汀組存活26只。再購(gòu)入30只3個(gè)月齡的Wistar鼠作為青年對(duì)照組。

1.3 心肌樣本的制備

灌胃4個(gè)月后，常規(guī)麻醉后快速取出心臟，部分心肌立即置于液氮中凍存?zhèn)溆?；部分心肌于冰凍切片機(jī)上，沿與心臟長(zhǎng)軸垂直方向進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為9 μm。將切片置于預(yù)冷的丙酮溶液中固定10 min后，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

1.4 心肌脂褐素、MDA含量的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的MDA、脂褐素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。取大鼠心肌樣本，以生理鹽水沖凈血液后，用濾紙吸去多余水分，稱重后放入勻漿器內(nèi)，加入9倍于組織重量的預(yù)冷生理鹽水，在冰浴條件下勻漿，制成10%的組織勻漿液，于4℃條件下3000 r/min離心15 min，取上清液保存。采用熒光法，測(cè)定組織中脂褐素的含量；采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定心肌MDA含量。

1.5 心肌衰老特異性β半乳糖苷酶含量檢測(cè)

采用衰老特異性β半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)中的方法操作。具體步驟如下：①每個(gè)心臟隨機(jī)選取3張切片，每張切片加500 μL清理液；②移去清理液，加500 μL固著液，室溫條件下放置10 min；③移去固著液，加500 μL酸性液，室溫條件下放置5 min后移去酸性液（本步驟共重復(fù)3次）；④切片平放于濕盒中，加500 μL染色液后，置于濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中，37℃條件下放置12 h，直至切片組織呈現(xiàn)出藍(lán)色后移去染色液；⑤加入500 μL清理液，片刻后移去清理液，加中性紅染色液后室溫條件下放置5 min；⑥移去清理液，在切片上加入中性紅染液，室溫下孵育5 min左右；⑦用蒸餾水沖去染色液，將切片在室溫下晾干后用中性樹(shù)膠封片。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，切片中呈藍(lán)色的細(xì)胞為衰老特異性β半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的β半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，比較各組大鼠心肌β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老大鼠心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的變化

與青年對(duì)照大鼠相比，老年對(duì)照大鼠的心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量含量均顯著增加（P<0.01），三者表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1 青年組與老年組心肌樣本衰老相關(guān)指標(biāo)變化情況（±s）

表1 青年組與老年組心肌樣本衰老相關(guān)指標(biāo)變化情況（±s）

注：與老年對(duì)照組比較，**P<0.01

青年對(duì)照組（n=30）老年對(duì)照組（n=27）326.7±39.5**504.8±40.3 50.9±11.1**98.5±16.3 2.1±0.3**51.9±13.7組別 脂褐素（U/mg）/prot丙二醛（nmol/mg）/prot衰老特異性β半乳糖苷酶（個(gè)/HP）

2.2 阿托伐他汀對(duì)老年大鼠心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的影響

與老年對(duì)照組相比，大小兩種劑量阿托伐他汀組的心肌組織中，MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶的含量均顯著降低（P<0.01）；其中，與小劑量組相比，大劑量他汀組大鼠心肌組織中的MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的下降水平均更為顯著（P<0.01或P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 阿托伐他汀對(duì)心肌衰老相關(guān)指標(biāo)含量的影響（±s）

表2 阿托伐他汀對(duì)心肌衰老相關(guān)指標(biāo)含量的影響（±s）

注：與老年對(duì)照組比較，**P<0.01；與小劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01

老年對(duì)照組（n=27）小劑量組（n=24）大劑量組（n=26）504.8±40.3 428.1±33.5**394.1±29.6**##98.5±16.3 77.4±14.0**64.3±15.8**##51.9±13.7 37.9±12.9**28.3±8.8**#組別 脂褐素（U/mg）/prot丙二醛（nmol/mg）/prot衰老特異性β半乳糖苷酶（個(gè)/HP）

2.3 不同組別間衰老特異性β半乳糖苷酶染色結(jié)果比較

心肌組織中衰老特異性β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性的細(xì)胞呈現(xiàn)出藍(lán)色。對(duì)各組樣本心肌組織的衰老特異性β半乳糖苷酶染色結(jié)果在顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，在高倍鏡視野下，青年對(duì)照組大鼠心肌中染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)非常少（圖1）；老年對(duì)照組大鼠心肌中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多（圖2）；大小兩種劑量的他汀組的心肌組織中，染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著少于老年對(duì)照組（圖3、4）；其中，與小劑量組相比，大劑量組的心肌組織染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)更低（圖3、4）。

圖1 青年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖2 老年對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖3 小劑量組大鼠心肌細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖4 大劑量組大鼠心肌細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

3 討論

當(dāng)前，在衰老發(fā)生的機(jī)制方面，主要包括自由基學(xué)說(shuō)、端粒酶學(xué)說(shuō)、線粒體DNA損傷學(xué)說(shuō)及微量元素學(xué)說(shuō)等，而自由基學(xué)說(shuō)在其中有著重要的地位[1]。研究表明[2-4]，代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量自由基如超氧陰離子、過(guò)氧化脂質(zhì)等是導(dǎo)致機(jī)體衰老的重要原因；過(guò)多的自由基會(huì)造成細(xì)胞膜、線粒體等重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，并可導(dǎo)致蛋白質(zhì)與酶等的活性發(fā)生變化；當(dāng)這種損傷超過(guò)了機(jī)體的承受能力時(shí)，就可引起細(xì)胞分化狀態(tài)的改變和喪失，最終導(dǎo)致與加速衰老的發(fā)生。

脂褐素、MDA、衰老特異性β半乳糖苷酶等作為反應(yīng)機(jī)體衰老狀態(tài)的指標(biāo)，已為大家所公認(rèn)，在很多研究中得到應(yīng)用[5-7]。既往的研究證實(shí)[8-10]，MDA、脂褐素、衰老特異性β半乳糖苷酶等在生物體內(nèi)的含量隨增齡而增高，上述指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)研究中常用于反映機(jī)體衰老水平及評(píng)價(jià)抗衰老干預(yù)措施的效果。因此，在本研究中，筆者選擇其作為反映老年大鼠心臟衰老狀態(tài)和評(píng)價(jià)阿托伐他汀干預(yù)效果的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，同青年大鼠相比，老年對(duì)照組大鼠心肌的脂褐素水平及MDA含量較青年大鼠顯著增高，同時(shí)其衰老特異性β半乳糖苷酶的活性較青年對(duì)照組大鼠也顯著增強(qiáng)，表明24個(gè)月齡的Wistar鼠的心臟出現(xiàn)了顯著的衰老性的改變，同時(shí)也說(shuō)明本研究所建立的衰老動(dòng)物模型是成功的。

作為目前臨床中應(yīng)用最為廣泛的一線調(diào)脂藥物，他汀類藥物的作用正日益受到廣大醫(yī)學(xué)工作者的重視。研究表明[8-11]，除降脂外，他汀類藥物還有著抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制心肌細(xì)胞肥厚等多種作用。近年來(lái)，關(guān)于他汀類藥物在心血管保護(hù)方面的研究有很多，但他汀長(zhǎng)期干預(yù)在心臟衰老保護(hù)方面的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以老年大鼠為研究對(duì)象，觀察阿托伐他汀的長(zhǎng)期干預(yù)對(duì)老年大鼠心肌脂褐素、MDA、衰老特異性β半乳糖苷酶等衰老相關(guān)指標(biāo)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，給予阿托伐他汀干預(yù)后，大鼠心肌的脂褐素含量及衰老特異性β半乳糖苷酶活性均顯著降低，提示阿托伐他汀可以明顯的抑制老年大鼠心肌的衰老性改變；同時(shí)，阿托伐他汀干預(yù)組的MDA較老年對(duì)照組也顯著降低，提示阿托伐他汀對(duì)抗大鼠心肌衰老性改變的作用，可能與其對(duì)大鼠心臟脂質(zhì)過(guò)氧化水平的抑制有關(guān)。筆者既往的研究也顯示，阿托伐他汀的長(zhǎng)期干預(yù)可顯著增強(qiáng)組大鼠心肌過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶等抗氧化酶的活性，也從另一個(gè)側(cè)面提示其抗衰老作用可能與其增強(qiáng)抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化水平有關(guān)。目前，關(guān)于阿托伐他汀抗衰老及抗氧化作用的具體機(jī)制還不清楚，還需要在今后的工作中進(jìn)一步研究。

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