任京力， 王雁梅， 宋國華， 康紅鈺， 孫明振

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校醫(yī)學生物工程重點實驗室，河南漯河462000)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在病理狀態(tài)如炎癥、損傷以及血流動力學改變時會發(fā)生表型轉化，即由正常的收縮型轉化為合成型，是臨床上多種心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、冠脈成形術后再狹窄、動脈瘤等發(fā)生的病理生理學基礎。鈣信號在VSMCs表型轉化中起著重要作用。Wamhoff等［1］首先報道在大鼠主動脈平滑肌細胞上去極化引起的鈣內流首先激活RhoA GTP結合蛋白(RhoA GTP-binding protein，RhoA)，繼而激活Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)，磷酸化其下游的LIM(3種同源異型結構域蛋白Lin-11、Isl-1和Mec-3)激酶(LIM kinase，LIMK)和絲切蛋白2(cofilin-2)，使纖維絲狀肌動蛋白(F-actin)降解減少，并可以引起胞漿中的血清反應因子(serum response factor，SRF)轉移至胞核內，調控VSMCs分化標志物如平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)、鈣結合蛋白(calponin)等的表達，對維持VSMCs的分化狀態(tài)非常重要;并且提出了“興奮-轉錄偶聯(lián)”的概念。小鼠門靜脈的VSMCs沿血管長軸縱向排列，與動脈VSMCs的環(huán)狀排列顯著不同。去極化刺激對平滑肌細胞分化的調控是否相同尚不完全清楚。肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)屬于轉錄調節(jié)因子MADS-Box家族，包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和 MEF2D這4種亞型，在骨骼肌和心肌的發(fā)育、分化過程中起重要作用［2-3］，但對VSMCs的分化調控尚無確切機制。為此，本研究擬原代培養(yǎng)小鼠門靜脈VSMCs，觀察去極化刺激對其分化的調節(jié)，探討MEF2在其中的作用機制，以期為血管表型轉換的防治提供新思路。

材料和方法

1 動物與試劑

SPF級昆明小鼠，25～30 g，雌雄不拘，購于河南省動物實驗中心。電壓依賴性鈣通道特異性阻斷劑維拉帕米(verapamil，Ver)、ROCK特異性抑制劑Y-27632、anti-calponin 抗體 、anti-α-SMA 抗體、Cy2/Cy5-conjugated anti-mouse secondary antibody等購于Sigma;total/phospho-ERK1/2、total/phospho-cofilin-2、total/phospho-LIMK等購于Cell Signaling;GAPDH和anti-Rho(clone 55)單克隆抗體購于Millipore;總RNA提取試劑盒、SM22α、MEF2A及MEF2B的引物購于Qiagen;MEF2C、MEF2D、GAPDH和心肌素(mycardin)引物購于北京三博遠志生物技術公司;膠原酶 II購于Invitrogen。

2 方法

2.1 門靜脈血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng) 按本室建立的方法并參考相關文獻［4］:在體式顯微鏡下，仔細去除血管外膜和內皮層，用眼科剪將門靜脈條剪成約2 mm×2 mm的碎片，置于含1 mL DEME培養(yǎng)液的 Eppendorf管中(含 1.4 g/L 膠原酶 II、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，1 000 r/min離心3 min，去掉上清液，加入1 mL新鮮DMEM(含10%胎牛血清)并輕微振蕩成懸液。然后將懸液轉移入新的35 mm培養(yǎng)皿或6孔板中，補充培養(yǎng)基至2 mL，重新置于細胞培養(yǎng)箱中孵育4～5 d，即見VSMCs從細胞碎片爬出，見圖1A。通過免疫組化(見方法2.2)及激光共聚焦顯微鏡掃描，可見VSMCs內呈現(xiàn)典型的肌絲樣結構，見圖1B、C，說明細胞處于分化狀態(tài)。將圖1A中的細胞常規(guī)胰酶消化、傳代、培養(yǎng)即為第2代的血管平滑肌細胞。本文中所有實驗均在第2代細胞上進行。

Figure 1.Identification of primarily cultured mouse portal vein VSMCs.A:primarily cultured VSMCs growing from the portal vein patch(× 100);B:smooth muscle αactin immunofluorescence assay(in red);C:calponin immunofluorescence assay(in red).SYTOX Green was used to stain nucleus(in green).Bar=20 μm in B and C.圖1 小鼠門靜脈血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

2.2 免疫組化 平滑肌細胞在適當?shù)拇碳ず螅?%多聚甲醛固定15 min后，與0.2%Triton X-100孵育10 min。然后與相應的Ⅰ抗在暗室中孵育2 h［anti-calponin(1∶10 000)、anti-α-SMA(1∶10 000)和anti-RhoA(1∶5］單克隆抗體)后，PBS洗滌3次，繼續(xù)與Ⅱ抗孵育(Cy2/Cy5-conjugated anti-mouse secondary antibody，1∶2 000)1 h，PBS 洗滌 3 次，以SYTOX Green進行核染色。所用樣本通過激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

2.3 Western blotting檢測蛋白質表達 原代培養(yǎng)的小鼠門靜脈VSMCs約90%融合時，加入0.2 mL/well蛋白裂解液(含1%PMSF、抑肽酶和亮肽素)裂解細胞。小心收集后超聲粉碎、離心，取上清液，考馬斯亮藍法蛋白定量。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加適當?shù)蘑窨梗?℃過夜，PBST洗滌3次，再加入相對應的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌 3次，用 ECL Advanced Western Blotting Detection Kit(Bio-Rad)顯色3～5 min后，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析處理。

2.4 siRNA轉染及實時熒光定量RT-PCR檢測mRNA表達 細胞的轉染按試劑供應商的說明書進行。為優(yōu)化轉染效果，設計了一系列的siRNA濃度(2～20 nmol/L)，同時設立對照RNA組。所用siRNA序列如下:MEF2A 5'-CAC ATT CTG CTG AAT TAT TTA-3';MEF2D 5'-CCG CCA GGT GAC CTT CAC CAA-3'。對照組siRNA序列為制造商專利。細胞總RNA提取按照供應商試劑盒的說明進行。實時熒光定量RT-PCR按照供應商試劑盒的說明在實時熒光定量PCR儀上進行。反應條件如下:50℃ 10 min，95℃ 5 min，37個循環(huán)，95℃ 10 s，60℃的退火和擴展。GAPDH為內參照，上游引物 5'-CCTGCCAAGTATGATGAC-3'，下游引物 5'-GGAGTTGCTGTT-GAAGTC-3';MEF2C上游引物5'-CCCAATCTTCTGCCACTG-3'，下游引物5'-GGTTGCCGTATCCATTCC-3';MEF2D上游引物5'-GCTATGGGTCATCTGTTC-3'，下游引物5'-ACTTGGATTGCTG AACTG-3';心肌素上游引物 5'-GCCACTGTGCGTCCTCCTACC-3'，下游引物5'-TCGGAACTTCCTTCTAATCAGCAAAGAG-3'。SM22α、calponin-1、calponin-2、MEF2A 及 MEF2B的引物序列為Qiagen合成。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組數(shù)據(jù)之間比較用Student's t檢驗。組間比較用單因素方差分析和Bonferroni post tests。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高鉀去極化刺激小鼠門靜脈VSMCs激活RhoA

用60 mmol/L KCl分別刺激 VSMCs 30 s、1 min和4 min后通過免疫組化觀察RhoA蛋白變化，同時設立空白對照組和維拉帕米組。結果顯示RhoA蛋白在高鉀去極化刺激后30 s即發(fā)生了明顯的胞膜移位，見圖 2B、C、D(箭頭所示)，5 μmol/L 維拉帕米則抑制了RhoA的胞膜移位，見圖2E。

Figure 2.Membrane translocation of RhoA upon 60 mmol/L KCl-induced depolarization.VSMCs were fixed after exposure to 60 mmol/L KCl for the indicated time and immunostained for RhoA using a Cy2-conjugated secondary antibody(green).Translocation of RhoA is shown by arrows.Verapamil inhibited membrane translocation of RhoA.A:control;B:cells treated with 60 mmol/L KCl for 30 s;C:cells treated with 60 mmol/L KCl for 1 min;D:cells treated with 60 mmol/L KCl for 4 min;E:cells treated with 60 mmol/L KCl for 4 min in the presence of 5 μmol/L verapamil.Bar=20 μm.圖2 RhoA蛋白在高鉀去極化刺激時發(fā)生胞膜移位

2 高鉀去極化刺激對LIMK和cofilin-2磷酸化的影響

60 mmol/L KCl分別刺激 VSMCs 10 min、30 min和60 min后，提取總蛋白，通過Western blotting檢測RhoA信號轉導通路中下游蛋白LIMK和cofilin-2的磷酸化表達變化。結果顯示LIMK的磷酸化在高鉀去極化刺激10 min后達到峰值，蛋白表達量增加了42.2%(P＜0.01)，見圖3A;其底物cofilin-2的磷酸化則在高鉀刺激30 min達到峰值，蛋白表達量增加了32.75%(P ＜0.01)，見圖 3B。5 μmol/L 維拉帕米能顯著抑制 LIMK(P＜0.01)和 cofilin-2(P＜0.05)對高鉀刺激的敏感性。這說明RhoA/ROCK/LIMK/cofilin-2信號途徑被高鉀引起的去極化激活。

Figure 3.Effects of 60 mmol/L KCl stimulus on the phosphorylation of LIMK(A)and cofilin-2(B).1:control;2:cells treated with 60 mmol/L KCl for 10 min;3:cells treated with 60 mmol/L KCl for 30 min;4:cells treated with 60 mmol/L KCl for 30 min in the presence of 5 μmol/L verapamil;5:cells treated with 60 mmol/L KCl for 60 min.Mean±SD.n=4 ～5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs group 1;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs group 3.圖3 高鉀去極化刺激對LIM激酶和絲切蛋白2磷酸化的影響

3 高鉀去極化刺激小鼠門靜脈VSMCs對轉錄因子心肌素及平滑肌標志物mRNA表達的影響

60 mmol/L KCl刺激 VSMCs 24 h后，提取總RNA后，通過real-time RT-PCR檢測轉錄因子心肌素及平滑肌標志物SM22α、calponin-1和calponin-2 mRNA的表達。結果顯示:高鉀刺激顯著增加心肌素(P ＜0.01)、SM22α(P ＜0.01)、calponin-1(P ＜0.01)及calponin-2(P＜0.01)mRNA的表達水平，見圖 4。5 μmol/L 維拉帕米 及 10 μmol/L Y27632(ROCK特異性抑制劑)均能完全抑制高鉀去極化刺激引起心肌素mRNA表達增加，見圖4A;5 μmol/L維拉帕米可完全抑制高鉀去極化引起的SM22α、calponin-1和calponin-2 mRNA表達增加(均P＜0.01)，見圖4B～D。這說明高鉀去極化通過激活 Rho/ROCK信號通路誘導心肌素表達的增加，進而調控平滑肌標志物的表達。

Figure 4.Effects of 60 mmol/L KCl stimulus on the mRNA expression of myocardin(A)and smooth muscle markers(B，C and D).1:control;2:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h;3:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h in the presence of 5 μmol/L verapamil;4:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h in the presence of 10 μmol/L Y27632.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs group 1;##P ＜0.01 vs group 2.圖4 高鉀去極化刺激對血管平滑肌細胞心肌素及平滑肌標志物mRNA表達的影響

4 高鉀去極化刺激小鼠門靜脈VSMCs對MEF2四種亞型mRNA表達的影響

60 mmol/L KCl刺激 VSMCs 24 h后，提取總RNA后，通過real-time RT-PCR檢測MEF2四種亞型mRNA的表達。結果顯示:MEF2A和MEF 2D mRNA表達顯著增加，分別增加 47.63%(P＜0.05)和48.15%(P＜0.01)，維拉帕米和ROCK的特異性抑制劑Y27632能顯著抑制MEF2A和MEF2D mRNA的表達(均P＜0.01)對高鉀刺激的敏感性，見圖5A、D。這說明高鉀去極化刺激 VSMCs引起的MEF2A和MEF2D表達增加受到Rho/ROCK信號通路的調控。而MEF2B和EEF2C mRNA表達對高鉀刺激不敏感，見圖5B、C。

Figure 5.Effects of high KCl-induced depolarization on the mRNA expression of MEF2 isoforms.1:control;2:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h;3:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h in the presence of 5 μmol/L verapamil;4:cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h in the presence of 10 μmol/L Y27632.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs group 1;##P ＜0.01 vs group 2.圖5 高鉀去極化對MEF2四種亞型mRNA表達的影響

5 高鉀去極化刺激對沉默MEF2A和MEF2D的VSMCs心肌素和SM22α mRNA表達的影響

分別設置空白對照組、無關對照組、假轉染組、陰性對照組和實驗組，用2～20 nmol/L siRNA分別轉染VSMCs 48 h后，提取細胞總RNA，通過real-time RT-PCR檢測沉默效果，發(fā)現(xiàn)10 nmol/L siRNA即能顯著抑制 MEF2A和 MEF2D mRNA的表達，見圖6A。在沉默MEF2A和MEF2D的VSMCs中，心肌蛋白mRNA的表達對高鉀去極化刺激不再敏感，見圖6B;但是SM22α的表達在高鉀去極化刺激后仍然顯著增加(P＜0.05)，見圖6C。這說明心肌素 mRNA的表達受控于MEF2A和MEF2D。SM22α的表達并沒有受到沉默MEF2A和MEF2D的影響，提示平滑肌標志物的表達除了受心肌素調控外，可能還存在另外的調控通路。

Figure 6.Effects of MEF2A/2D knockdown on the sensitivity of myocardin and SM22α mRNA expression to high KCl-induced depolarization.A:MEF2A and MEF2D mRNA expression.1:empty control;2:scrambled siRNA control;3:vehicle control;4:negative control;5:cells transfected with 2 nmol/L siRNA;6:cells transfected with 10 nmol/L siRNA;7:cells transfected with 20 nmol/L siRNA.Mean±SD.n=3.B and C:myocardin and SM22α mRNA expression，respectively.1:wild type control;2:wild type control cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h;3:MEF2A knockdown;4:MEF2A knockdown cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h;5:MEF2D knockdown group;6:MEF2D knockdown cells treated with 60 mmol/L KCl for 24 h.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01 vs group 1;#P ＜0.05 vs group 3;△P ＜0.05 vs group 5.圖6 沉默MEF2A/2D對高鉀去極化引起的心肌素和SM22α mRNA表達的影響

討 論

VSMCs具有收縮表型和合成表型。收縮表型VSMCs胞漿內主要是收縮纖維、游離核糖體及高爾基體，內質網(wǎng)很少，分布于核周區(qū)域，主要對機械刺激和化學物質起收縮反應并維持血管壁的張力;合成表型VSMCs有少量肌纖維，大量的高爾基體、游離核糖體和粗面內質網(wǎng)，具有合成功能，主要參與細胞外基質的形成和合成血管活性物質，合成表型的VSMCs見于生長和修復過程，而VSMCs在血管損傷因素刺激下發(fā)生的表型轉換是其獲得增殖能力的決定因素［5-6］。因此，闡明VSMCs增殖的發(fā)生機制，對防治血管重塑和逆轉增殖性血管病變具有重要的意義。MEF2是MADS(酵母MCMI基因、擬南芥AGAMOUS基因、金魚草DEFTCI基因及人類SRF基因的英文首字母)家族成員之一，在動物發(fā)育過程中起到重要的調節(jié)作用。在脊椎動物中，MEF2基因是由4個基因(MEF2A、MEF2B、MEF2C 和 MEF2D)組成的多基因家族。MEF2廣泛存在于肌肉組織、心肌組織和神經(jīng)組織。MEF2蛋白的N末端序列保守，包含MADS結構域和MEF2結構域，能夠與其它因子形成二聚體并具有DNA結合活性;C末端含有磷酸化位點，是多種激酶的靶點，與啟動基因表達有關，是MEF2因子活性調節(jié)及發(fā)揮功能的主要區(qū)域。對骨骼肌和心肌細胞分化過程的調控研究表明MEF2最突出的功能是控制肌細胞分化過程中的基因轉錄，主要作用是在骨骼肌、心肌和平滑肌的發(fā)育過程中介導細胞的分化［7-9］。但MEF2對VSMCs分化過程的調控報道不多，并且有不同的結論［10-12］。

本研究觀察到:首先，在原代培養(yǎng)的小鼠門靜脈VSMCs中，60 mmol/L KCl去極化刺激可激活Rho/ROCK-LIMK-cofilin-2信號轉導通路，表現(xiàn)為RhoA蛋白發(fā)生顯著的胞膜移位，其下游底物LIMK以及cofilin-2的磷酸化分別在去極化刺激10 min和30 min達到峰值，并且上述變化均對5 μmol/L維拉帕米敏感。與Wamhoff等［1］的報道一致;其次，平滑肌標志物的重要調控因子心肌素mRNA表達的顯著增加具有高鉀去極化依賴性并受到Rho/ROCK信號通路的調控，表現(xiàn)為其表達對5 μmol/L維拉帕米和ROCK特異性抑制劑 Y27632敏感;再次，心肌素mRNA表達還受MEF2A和MEF2D的調控，表現(xiàn)為在沉默MEF2A和MEF2D兩種亞型的VSMCs，心肌素的表達失去了對高鉀去極化刺激的敏感性。這與在心臟和骨骼肌中，心肌素受MEF2調控的報道相一致［13-14］，提示 MEF2A/2D與心肌素很可能作為RhoA/ROCK信號轉導通路的一個新的分支在調控平滑肌標志物的表達過程中起重要作用。最后，在沉默MEF2A和MEF2D的VSMCs中，高鉀去極化刺激仍然能引起SM22α表達顯著增加，提示平滑肌特異基因的調控可能通過其它通路，如RhoA/ROCK/LIMK/mDia/profilin 信號通路進行代償［15］。至于MEF2A和MEF2D之間如何協(xié)同作用，以及是否與其它轉錄因子相互作用調節(jié)VSMCs的分化過程有待進一步實驗研究。

綜上所述，MEF2A和MEF2D通過調控心肌素的表達參與了高鉀去極化引起的VSMCs平滑肌標志物的表達。

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