胡穎菲， 陸兔林*， 毛春芹， 吳 皓， 弓曉東， 周云中， 王 菊， 張 星

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046;2．南通精華制藥股份有限公司，江蘇南通226005)

大柴胡顆粒，是在東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景創(chuàng)立的“大柴胡湯”的基礎(chǔ)上，根據(jù)現(xiàn)代制劑工藝制備的顆粒劑，由柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí) (炒)、芍藥、半夏 (姜)、生姜、大棗八味藥材組成，具有和解少陽(yáng)、內(nèi)瀉熱結(jié)之功效，臨床主要用于急慢性膽囊炎的治療［1］。柴胡為方中君藥，黃芩、枳實(shí)、大黃共為臣藥，主要活性成分包括黃酮類、萜類、皂苷、蒽醌和香豆素等，其中以枳實(shí)與黃芩中的黃酮類成分 (柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷等)量最高。目前有關(guān)大柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，僅見(jiàn)對(duì)黃芩苷進(jìn)行定量檢測(cè)分析［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法 (TLC)對(duì)黃芩、大黃、枳實(shí)、白芍進(jìn)行定性鑒別，高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷，為全面有效控制大柴胡顆粒的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent1200高效液相色譜儀 (G1315C DAD檢測(cè)器)，Chem Station色譜工作站;KQ-500B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);AB104-L分析天平 (德國(guó)梅特勒公司);HH-S型水浴鍋 (鞏義市英峪予華儀器廠);硅膠G、H薄層板 (青島海洋化工廠);紫外分析儀WD-9403C型 (北京市六一儀器廠)。

柚皮苷對(duì)照品 (批號(hào)110722-201111)、橙皮苷對(duì)照品 (批號(hào)110721-200905)、新橙皮苷對(duì)照品 (批號(hào)111857-201102)、黃芩苷對(duì)照品 (批號(hào)110715-201014)、黃芩對(duì)照藥材 (批號(hào) 120955-201008)、大黃對(duì)照藥材 (掌葉大黃，批號(hào)121249-201003)、枳實(shí)對(duì)照藥材 (批號(hào) 120936-201005)、白芍對(duì)照藥材 (批號(hào)120905-201109)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;大柴胡顆粒樣品及處方藥材 (江蘇南通精華制藥有限公司提供);乙腈 (美國(guó)Tedia公司)、甲醇 (上海凌峰化學(xué)試劑公司)為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜 (TLC)鑒別

2.1.1 黃芩的 TLC鑒別［3］取本品2 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，超聲20 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，離心 (4 800 r/min，15 min)傾出上清液，鹽酸調(diào)pH 1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺黃芩的陰性樣品2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (10∶3∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。黃芩的薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Scutellariae Radix

2.1.2 大黃的 TLC鑒別［4-5］取本品0.5 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，超聲10 min，濾過(guò)，取濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用三氯甲烷分2次振搖萃取，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺大黃的陰性樣品0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法 (附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚 (30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸 (15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。大黃的薄層色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 大黃TLC色圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Rhei Radix et Rhizoma

2.1.3 枳實(shí)的 TLC鑒別［6］取本品2 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，密塞，超聲20 min，濾過(guò)，取濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL作為供試品溶液。另取枳實(shí)對(duì)照藥材，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺枳實(shí)的陰性樣品2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。分別吸取上述溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水 (20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。枳實(shí)的薄層色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 枳實(shí)TLC色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Aurantii Fructus immaturus

2.1.4 白芍的TLC鑒別［7］取本品1.5 g，研細(xì)，加70%甲醇20 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺白芍陰性樣品1.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(8∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。白芍的薄層色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 白芍TLC色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Paeoniae Radix alba

2.2 黃酮類成分 (黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)HPLC定量測(cè)定［8-12］

2.2.1 色譜條件 漢邦Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6mm，5μm)，乙腈 (A) －0.2%醋酸水溶液 (B)為流動(dòng)相梯度洗脫，0 min(5%A)，28 min(26%A)，36 min(26%A)，48 min(40%A)，體積流量為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL，理論塔板數(shù)按柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷計(jì)算均不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 分別稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置2mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密量取單個(gè)組分對(duì)照品溶液，加甲醇配成每1 mL分別含柚皮苷0.193 8 mg、橙皮苷0.109 6 mg、新橙皮苷0.128 7 mg、黃芩苷0.452 5 mg的混合對(duì)照品液。

2.2.3 供試品溶液的配制 取大柴胡顆粒適量，研細(xì)，精密稱取1.00 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，用時(shí)過(guò)0.45μm的濾膜。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液配制 按處方比例分別稱取除黃芩、枳實(shí)以外的其余藥味，按照制備工藝制成缺黃芩、缺枳實(shí)、同時(shí)缺黃芩和枳實(shí)的陰性樣品，按2.2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法操作，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，液相色譜圖見(jiàn)圖5。陰性樣品在指標(biāo)成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的色譜峰位置上無(wú)吸收，表明該方法的專屬性良好。

圖5 大柴胡顆粒的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram s of Dachaihu Granules

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸，求得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種有效成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of four compounds

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.80%、0.89%、0.79%、1.44%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為110801的大柴胡顆粒樣品1份，按照供試品溶液的制備方法制備供試品液，分別在0、2、4、8、12、20 h測(cè)定樣品中各組分的峰面積，測(cè)得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.32%、1.19%、1.68%、1.15%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為110801的大柴胡顆粒樣品6份，每份1.00 g，按照供試品溶液的制備方法制備供試品液，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù) (n=6)分別為5.764 2 mg/g、 2.907 4 mg/g、 3.422 2 mg/g、16.523 2 mg/g，RSD分別為 1.50%、2.39%、1.93%、2.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取批號(hào)為110801的大柴胡顆粒樣品9份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液 (含柚皮苷2.882 3 mg/mL、橙皮苷1.456 1 mg/mL、新橙皮苷1.702 8 mg/mL、黃芩苷8.262 4 mg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及黃芩苷的平均回收率分別為99.94%、95.83%、97.46% 和 98.94%，RSD 分 別 為1.89%、1.72%、2.21%和2.68%。

表2 大柴胡顆粒中4種成分加樣回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of four com pounds in Dachaihu Granules(n=9)

2.2.11 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的大柴胡顆粒，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大柴胡顆粒4種成分的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of four com pounds in Dachaihu Granules(n=3)

3 討論

一般質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，主要是選擇方中一到兩個(gè)主要成分進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)選擇柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷作為大柴胡顆粒的定量指標(biāo)，有以下幾個(gè)原因。這4種成分均是黃酮類物質(zhì)，在280 nm附近有最大吸收，同一色譜條件下能很好地分離;同時(shí)，方中君藥柴胡中的柴胡皂苷量極低，且不易檢測(cè);柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳實(shí)中最主要的活性成分，黃芩苷是黃芩中量最高的活性物質(zhì)，故選擇臣藥黃芩、枳實(shí)中的主要成分作為大柴胡顆粒的定量指標(biāo)。4種黃酮類成分同時(shí)定量檢測(cè)對(duì)于控制大柴胡顆粒的質(zhì)量有著重要意義。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑如水、95%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇，結(jié)果以甲醇提取較完全。比較了超聲提取和回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果相當(dāng)，因超聲提取簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間，故選擇超聲提取法。對(duì)提取時(shí)間 (30 min、40 min、50 min)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)30 min即可提取完全。同時(shí)，比較了多種流動(dòng)相系統(tǒng)，包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇-水體系基線漂移，乙腈-水體系基線平穩(wěn)，各峰分離度較好，但黃芩苷未見(jiàn)出峰，乙腈-醋酸水系統(tǒng)各峰分離較好。又考察了乙腈-0.05%醋酸水、乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%醋酸水3個(gè)流動(dòng)相體系，結(jié)果以乙腈-0.2%醋酸水為流動(dòng)相各成分峰形較好，各峰間的分離度均達(dá)到1.5以上。故選擇流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸水梯度洗脫。

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