況 剛 ，楊 林 ，鄭小平 ，何 丹

(1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 410021; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016)

青蒿Artemisia annuaL.是菊科1年生草本植物，是唯一含青蒿素的蒿屬植物，又名黃花蒿，為重慶道地藥材，主要藥效成分青蒿素(artemisinin)是非常有效的瘧疾治療藥物[1]。青蒿素的傳統(tǒng)提取生產(chǎn)工藝主要有有機(jī)溶劑萃取、超亞臨界流體萃取、微波萃取等方法[2]，但都存在提取率有限、雜質(zhì)多、能耗高、試劑回收率低、資源嚴(yán)重浪費(fèi)等不足。因此，尋找一種高效、低毒、穩(wěn)定、適合工業(yè)化的青蒿素提取工藝對于重慶道地藥材的利用開發(fā)尤為重要。本研究中采用濁點(diǎn)萃取技術(shù)提取青蒿中的青蒿素，以正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，為青蒿素的高效、環(huán)保提取提供新方法。

1 儀器與試藥

UV 240型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);Model 800型超速離心機(jī)(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司);KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲洗器有限公司);電子恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。青蒿素對照品(批號為100202－201004，中國食品藥品檢定研究院);青蒿藥材采集于重慶各青蒿種植區(qū)縣，由重慶市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室鄭小平主管中藥師鑒定為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.干燥地上部分;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 青蒿的提取

將青蒿粉末干燥，過60目，取約10.0 g，精密稱定。向其中加入20 mL Genapol－X 80(10%)，磁力攪拌混合均勻，300 W超聲處理40 min后，4 000 r/min離心15 min，取上清液，加入適量鹽溶液，再次混合均勻，60℃恒溫水浴30 min，再4 000 r/min離心15 min，至溶液清晰地分為兩層，上層為表面活性劑富集相，下層為水相。分液漏斗中分離去水相，上層表面活性層中加入2 mL甲醇，以降低黏度，用超濾膜過濾，回收表面活性劑，濾液旋干，得青蒿提取物。

2.2 青蒿素的含量測定[3]

2.2.1 溶液制備

精密稱取濁點(diǎn)萃取得到的青蒿提取物0.88 g，溶解至25 mL容量瓶中，加入 0.2%NaOH溶液7 mL，于(50±1)℃水浴加熱 30 min，進(jìn)行衍生，取出，冷水快速冷卻，0.22 μm 纖維素濾膜濾過，得供試品溶液。精密稱取青蒿素對照品50.0 mg，無水乙醇溶解，50 mL容量瓶定容，得質(zhì)量濃度為1 g/L的對照品溶液。

2.2.2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取對照品溶液 1，2，3，4，5 mL，置 25 mL容量瓶中，按供試品溶液同法處理，以無水乙醇為空白，在292 nm波長處測定吸光度值，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線，回歸方程為A=0.015 30C+0.001 6，r=0.999 6(n=5)。結(jié)果表明，青蒿素質(zhì)量濃度在 0.04 ～0.2 g/L 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一對照品溶液，依法在292 nm波長處測定吸光度。結(jié)果平均吸光度為 0.168，RSD為 0.56%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，于12 h內(nèi)隔1 h測定1次吸光度。結(jié)果平均吸光度為 0.165，RSD為 1.1%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取青蒿提取物，依法制備供試品溶液并測定吸光度。結(jié)果青蒿素平均含量為15.34 mg/g，RSD為0.72%(n=5)，表明方法重復(fù)性好。

回收率試驗(yàn):取已知含量的青蒿提取物，加入適量青蒿素對照品，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.3%，RSD為1.45%(n=5)，表明方法回收率較好。

2.2.3 樣品含量測定

以無水乙醇作為空白參比，取青蒿提取物，依法制備供試品溶液，在292 nm波長處測定吸光度，計(jì)算含量。

2.3 提取工藝條件的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)，以液固比(因素A)、平衡時(shí)間(因素B)、鹽溶液離子強(qiáng)度(因素C)、聚氧乙烯脂肪醇醚(Genapol－X 80濃度，因素D)為考察因素，每因素取3水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表1，結(jié)果見表2。可見，在影響濁點(diǎn)萃取法提取青蒿素的4個(gè)因素中，影響的大小次序?yàn)橐汗瘫?、Genapol－X 80濃度、離子強(qiáng)度、平衡時(shí)間。各因素的優(yōu)化工藝參數(shù)為A2B3C1D2，即液固比為 100∶1，平衡時(shí)間為 40 min，離子強(qiáng)度為 2.0 mol/L，Genapol－X 80濃度為 15.0%。此時(shí)青蒿素提取率最高，為15.33%。

2.4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果青蒿素平均提取率為15.32 mg/g，RSD為1.1%(n=3)，表明該工藝合理可行。

3 討論

濁點(diǎn)萃取技術(shù)(cloud point extraction，CPE)以水代替有機(jī)溶劑作為萃取劑，通過加入少量表面活性劑產(chǎn)生濁點(diǎn)現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)高效提取[4]。其原理是，表面活性劑結(jié)構(gòu)上的親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)分別與水和待提取的有效成分結(jié)合，形成疏水基團(tuán)在內(nèi)、親水基團(tuán)在外的膠束，從而顯著提高水溶性不佳的有機(jī)物水提時(shí)的溶解度[5];同時(shí)，表面活性劑水溶液加熱到一定溫度(濁點(diǎn)溫度)后，溶液變渾濁并出現(xiàn)分相，通過改變試驗(yàn)參數(shù)(如溶液的離子強(qiáng)度、溫度等)引發(fā)相分離，最終實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的高效富集和分離[6－7]。

表1 濁點(diǎn)萃取的因素水平表

表2 濁點(diǎn)萃取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

用濁點(diǎn)萃取法提取青蒿中青蒿素，具有操作簡單、綠色環(huán)保、避免高溫破壞和提取率高等優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)中優(yōu)化了液固比、平衡時(shí)間、鹽溶液離子強(qiáng)度、表面活性劑濃度等影響萃取效率的各種因素，得到最佳工藝，為青蒿素的提取提供了一種新的方法。

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[2]李子穎，李士雨，齊向娟.青蒿素提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2002，2(4):17 －20.

[3]左巨波，代廣會，楊俊卿，等.現(xiàn)場快速檢測青蒿藥材質(zhì)量的方法研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34(2):206 －209.

[4]申進(jìn)朝，邵學(xué)廣.濁點(diǎn)萃取技術(shù)及其在有機(jī)化合物分離分析中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展，2006，18(4):482.

[5]王志龍.非離子表面活性劑為溶媒的濁點(diǎn)萃取技術(shù)[J].化學(xué)工程，2006，34(4):9.

[6]J Zhou，SW Wang，LX Sun.Determination of Osthole in rat plasma by high－ performance liquid chromatograph using cloud－point extraction[J].Anal Chim Acta，2008，608(2):158.

[7]J Zhou.LX，Sun，SW Wang.Micelle －mediated extraction and cloud －point preconcentration of Osthole and imperatorin from Cnidium monnieri[J].J Chromatogr A，2008，1200(2):93.