馬光磊，俞孝珍

(杭州九源基因工程有限公司，浙江 杭州 310018)

依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)系從豬腸黏膜提取的肝素鈉芐酯衍生物經(jīng)堿裂解而得的低分子量肝素鈉鹽，已廣泛用于預(yù)防深靜脈血栓、治療血栓形成和血液透析抗凝[1－2]。在依諾肝素鈉的生產(chǎn)過程中用到了甲醇、乙醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑，藥物中有機(jī)溶劑的殘留若大于一定限度，對人體會有危害，因此《中國藥典》對各有機(jī)溶劑的限量均有規(guī)定，甲醇、乙醇、二氯甲烷分別為0.3% ，0.5%，0.06%[3]。本研究中采用頂空氣相色譜法建立了依諾肝素鈉原料藥中殘留溶劑的測定方法，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

6890 型全自動氣相色譜儀(Agilent公司)，氫離子火焰檢測器)。依諾肝素鈉原料(杭州九源基因工程有限公司);甲醇、乙醇、二氯甲烷均為市售分析純試劑，水為18 Ω純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent HP－5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.5 μm);載氣:高純氮?dú)?純度不低于 99.99%);檢測器:FID;柱流速:1.0 mL/min;氣化室溫度:200℃;檢測器溫度:250℃;氫氣流速:40.0 mL/min;空氣流速:不低于400 mL/min;柱溫:30℃(5 min，40℃ /min)→120℃;分流比:1∶1。頂空加熱溫度:85℃;平衡時(shí)間:20 min;進(jìn)樣環(huán)溫度:100℃;傳送帶溫度:110℃;進(jìn)樣體積:頂空瓶上部氣體1 mL，自動頂空進(jìn)樣。

2.2 溶液配制

定位溶液:分別精密吸取甲醇10 μL，乙醇25 μL，二氯甲烷2 μL，置 100 mL 容量瓶中，加水至 100 mL，搖勻，即得。

限量對照溶液:精密吸取甲醇(相對密度0.79)10 μL，乙醇(相對密度 0.79)25 μL，二氯甲烷(相對密度 1.32)2 μL，分別置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得相當(dāng)于甲醇，乙醇，二氯甲烷質(zhì)量濃度分別為 0.08，0.2，0.025 g/L 的混合限量對照溶液

系列對照品溶液:精密量取 20 μL 甲醇、50 μL 乙醇、4 μL 二氯甲烷，置100 mL容量瓶內(nèi)，加注射用水至刻度，作為對照液Ⅰ;取對照液Ⅰ稀釋1倍作為對照液Ⅱ;取對照液Ⅰ稀釋10倍作為對照液Ⅲ;取對照液Ⅰ稀釋20倍作為對照液Ⅳ，取對照液Ⅰ稀釋40倍作為對照液Ⅴ。以上系列對照溶液中各有機(jī)溶劑的質(zhì)量濃度分別為甲醇 0.004，0.008，0.016，0.08，0.16 g/L，乙醇 0.01，0.02，0.04，0.2，0.4 g/L 和二氯甲烷 0.001 25，0.002 5，0.005，0.025，0.05 g/L。

供試品溶液:取樣品0.2 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加水5.0 mL溶解，即得。

2.3 方法學(xué)考察

定位與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):取定位溶液分別進(jìn)樣測定，獲得各有機(jī)溶劑的保留時(shí)間;然后取限量對照溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，計(jì)算各成分峰的柱效、分離度，重復(fù)進(jìn)樣響應(yīng)值的RSD值，結(jié)果見表1。各組分色譜峰的理論板數(shù)均大于150 000，分離度大于1.5。同法測定空白溶劑色譜圖和樣品色譜圖，結(jié)果見圖1，可見空白溶劑對3種殘留溶劑的測定無干擾。

表1 殘留溶劑的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

圖1 氣相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取系列對照液5 mL，置頂空瓶中，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 各組分回歸方程與線性范圍(n=5)

最低檢測限確定:將對照品溶液逐級稀釋，測定。當(dāng)信噪比為3 時(shí)，甲醇、乙醇、二氯甲烷的最低檢測限分別為 4，1.6，1.2 μg/mL，相當(dāng)于被檢樣品的0.01%，0.004%和0.003%。

精密度試驗(yàn):精密量取對照品溶液5 mL，共6份，分別置頂空瓶中，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果甲醇、乙醇、二氯甲烷的日內(nèi)精密度RSD分別為 4.14% ，4.08% ，3.12%(n=6)，日間精密度分別為 4.21%，3.89%，4.49%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):以限量對照溶液為100%，取限量溶液濃度的80%，100%，120%3個(gè)濃度水平作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取同一批的依諾肝素鈉0.2 g，精密稱定，分別置9個(gè)20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，平行配制3份，作為回收率測定用溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

耐用性試驗(yàn):于3 d內(nèi)每天由不同的操作人員在同樣的方法和環(huán)境下對同樣方法下配置的樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果RSD分別為甲醇 5.44% ，乙醇 4.23%，二氯甲烷 5.71% 。

2.4 樣品含量測定

按照上述色譜條件測定3批樣品中殘留溶劑，外標(biāo)峰面積法計(jì)算殘留溶劑含量。結(jié)果樣品中未檢測到乙醇和二氯甲烷，甲醇含量為0.043%，均符合規(guī)定，故樣品中溶劑殘留量符合要求。

3 討論

通過上述研究，結(jié)果表明，乙醇，二氯甲烷殘留量控制與ICH相同，甲醇?xì)埩袅靠刂葡蘖扛蜑?.2%。因此，該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，是檢測依諾肝素鈉有機(jī)溶劑殘留的可行方法。

[1]姚立新.FDA批準(zhǔn)首個(gè)依諾肝素鈉注射劑仿制藥用于預(yù)防深度靜脈血栓形成[J].廣東藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010(4):78.

[2]林劍萍.依諾肝素的臨床應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5(20):65－66.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄61.