李曉蕓，龔 蓓，韓 穎，王 菲，邱 祥，干仲元，王 冰，張 彤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

凍瘡是一種季節(jié)性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，好發(fā)于肢體的末梢和暴露的部位，如手、足、鼻尖、耳邊、耳垂和面頰部[1]。中醫(yī)認(rèn)為，凍瘡乃皮膚肌肉受嚴(yán)寒侵襲、氣血運(yùn)行不暢致氣血凝滯而成，故臨床治療以溫經(jīng)散寒、活血化瘀、消腫止痛為主。當(dāng)歸四逆湯源于《傷寒論·厥陰篇》，“手足厥寒，脈細(xì)欲絕者，當(dāng)歸四逆湯主之”，有溫養(yǎng)經(jīng)脈、通暢血行之功，為治療凍瘡的代表方?；ń飞⒑凉?，與當(dāng)歸四逆湯同用，可助其溫經(jīng)通脈之力而增強(qiáng)療效。因此，在尊重仲景原方基礎(chǔ)上，選用當(dāng)歸四逆湯加味花椒，分別采用水煎法和滲漉法提取，結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)不同提取方法制備的中藥提取物預(yù)防凍瘡的效果。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);FA2004型電子天平(上海天平儀器廠);YLS－6B型智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)。當(dāng)歸等藥材購(gòu)自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司;硫化鈉、戊巴比妥鈉為化學(xué)純，乙醇為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SD大鼠30只(體重160～200 g，雌雄兼用)，昆明種小鼠30只(體重18～22 g，雌性)，均購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2009－0019。所有受試動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25℃，相對(duì)濕度40% ～70%，晝夜明暗交替(12 h/12 h)，自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 處方組成

當(dāng)歸 9 g，桂枝 9 g，赤芍 9 g，白芍 9 g，細(xì)辛 3 g，炙甘草 6 g，通草 6 g，大棗 9 g，花椒 6 g。

1.2.2 提取工藝

水煎煮法:將藥材先以適量水浸潤(rùn)0.5 h，再加水煎煮2次，依次為處方的8倍量和6倍量水，煎煮時(shí)間依次為1.5 h和1 h，合并上述水煎液，濃縮至適當(dāng)濃度(每1 g提取物相當(dāng)于4.0 g生藥)，冷藏備用。

滲漉提取法:將藥材適當(dāng)粉碎，以適量80%乙醇浸潤(rùn)1 h，裝入滲漉筒，以80%乙醇浸泡12 h后，將8倍量的溶劑以2 mL/min速度進(jìn)行滲漉操作，收集滲漉液，將藥液于60℃減壓濃縮至適當(dāng)濃度(每1 g提取物相當(dāng)于4.0 g生藥)，冷藏備用。

1.2.3 藥效試驗(yàn)

動(dòng)物分組:將30只SD大鼠隨機(jī)分為4組，空白組6只、模型組10只、水煎組及滲漉組各7只;將30只昆明種小鼠經(jīng)鎮(zhèn)痛試驗(yàn)初篩合格后隨機(jī)等分為兩組。

模型建立[2]:將大鼠固定于固定架上，用1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠;3～5 min后用彎剪緊貼皮膚粗略剪去背部?jī)蓚?cè)試驗(yàn)部位被毛，大小為直徑4 cm左右的圓形區(qū)域;用8%硫化鈉溶液快速蘸洗試驗(yàn)部位，2～3 min后待被毛溶解成糊狀，用濕紗布擦洗干凈;脫毛后立即用溫水徹底洗凈，使試驗(yàn)部位皮膚裸露，備用。將準(zhǔn)備好的1元錢硬幣全部浸入液氮罐中15 min，使其充分冷卻至－196℃;將備好皮的大鼠放于液氮灌旁邊以減少實(shí)驗(yàn)誤差;然后取出1枚硬幣。立即將其貼緊大鼠背部一側(cè)試驗(yàn)部位，造成皮膚局部?jī)鰝?。硬幣直徑?5 mm、厚2 mm，致傷范圍以此大小作為1個(gè)瘡面，至傷時(shí)間8 s。

藥效評(píng)價(jià)方法選擇:復(fù)溫第2天給藥組分別于凍傷局部給予水煎、滲漉提取物(2.5 g/mg)涂擦，連續(xù)5 d。第7天采用凍瘡治療前后皮膚外觀比較、抗炎－腫脹度檢查法、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)法、組織切片等方法綜合評(píng)價(jià)中藥提取物防治凍瘡的效果。

凍瘡治療前后皮膚外觀描述:通過(guò)皮損處紅斑大小、腫脹程度、水皰及糜爛等外觀改變，評(píng)價(jià)凍瘡康復(fù)情況。凍瘡分度[3]，Ⅰ度為開(kāi)始可有暫時(shí)滲出，色紫或青，可伴有浮腫，觸之有涼冷感，此時(shí)遇暖，顏色可轉(zhuǎn)為紅腫，并出現(xiàn)瘙癢、疼痛;Ⅱ度為受凍較重，小動(dòng)脈收縮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織損傷加重，在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生水皰或大皰，內(nèi)容清晰，皰破后形成糜爛滲出液或結(jié)痂;Ⅲ度為受凍較重，組織壞死，形成潰瘍。參考文獻(xiàn)[4]，擬訂紅斑、腫脹、水皰及糜爛滲出液的記分方法。紅斑，無(wú)紅斑記0分，紅斑直徑小于1 cm記1分，1～2 cm記2分，大于2 cm記3分;腫脹，無(wú)腫脹記0分，輕微腫脹記1分，腫脹、有繃緊感記2分，腫脹明顯且局部發(fā)亮記3分;水皰及糜爛，出現(xiàn)水皰記3分，出現(xiàn)糜爛記4分，滲出液較少記5分，滲出液較多、可流出記6分。

抗炎－腫脹度(稱重法)[5]:大鼠處死后，剝下大塊脫毛皮膚，除去皮下脂肪，攤至硬質(zhì)木板上，在非凍傷處與凍傷腫脹處分別取下直徑7 mm的圓形皮膚，立即稱重。以兩圓形皮膚質(zhì)量之差作為腫脹值，計(jì)算腫脹抑制率。腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%。

鎮(zhèn)痛作用(熱板法)[6]:取小鼠，放在加熱至55℃的金屬板上，以舔后足為痛反應(yīng)指標(biāo)，共測(cè)2次，以每次不超過(guò)30 s者為合格鼠，取平均值為給藥前痛閾值。將預(yù)選合格鼠隨機(jī)等分為生理鹽水、水煎、滲漉3組，生理鹽水組分2次給藥、每次間隔1 h，水煎組與滲漉組分3次給藥、每次間隔1 h，末次給藥后0.5 h測(cè)定給藥后痛閥值。

組織切片[7]:切取大鼠凍傷皮膚組織標(biāo)本，經(jīng)固定、水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)切片、蘇木精－伊紅染色、中性樹(shù)膠封固后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。主要觀察不同組別皮下的水腫、血管等情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布、方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD法。校驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 皮膚外觀描述

結(jié)果見(jiàn)表1。模型組及給藥組造模后，均為Ⅱ度凍瘡。治療后模型組均結(jié)痂;水煎組及滲漉組均結(jié)痂、長(zhǎng)毛，腫脹消退，紅斑明顯縮小。結(jié)果表明，大鼠凍傷后有一定的自愈能力，且水煎與滲漉提取物均有利于凍傷的恢復(fù)。

2.2 抗炎－腫脹度試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，水煎與滲漉的提取物均可明顯降低大鼠凍傷后皮膚的腫脹度，且水煎組的療效好于滲漉組。

2.3 鎮(zhèn)痛作用試驗(yàn)

將生理鹽水組按每次每1 kg體重10 mL分2次涂于小鼠后足，水煎組與滲漉組按每次2.5 g/kg涂于小鼠后足分3次給藥，末次給藥后測(cè)定痛閾值。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，水煎、滲漉提取物局部涂擦后對(duì)熱板致痛小鼠有明顯的鎮(zhèn)痛作用，而水煎與滲漉提取物之間差異不明顯。

表1 當(dāng)歸四逆湯加味對(duì)凍傷大鼠的影響(±s)

表1 當(dāng)歸四逆湯加味對(duì)凍傷大鼠的影響(±s)

注:與本組試驗(yàn)前比較，▲P＜0.01;△P＜0.05;與模型組比較，＊P ＜0.05;與水煎組比較，#P ＜0.05。

組別 外觀積分(分) 腫脹度腫脹抑制率(%)治療前 治療后 差值 平均腫脹度模型組水煎組滲漉組72.09 34.88 2.286 ±0.951 1.857 ± 0.690 2.429 ± 0.535 1.714±0.951△1.000 ±0.577▲1.429 ±0.535▲0.571 ±0.535 0.857 ± 0.380 1.000 ± 0.218 0.043 ±0.016 0.012 ± 0.011＊0.028 ±0.008＊#

表2 當(dāng)歸四逆湯加味對(duì)熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用(± s，s)

表2 當(dāng)歸四逆湯加味對(duì)熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用(± s，s)

組別生理鹽水組水煎組滲漉組劑量10 mL/kg 2.5 g/kg 2.5 g/kg動(dòng)物數(shù)(只)10 10 10給藥前后痛閾值差0.655 ± 0.734 4.359 ± 1.347＊4.170 ± 3.138＊

2.4 組織切片

分別切取空白組、模型組、水煎組及滲漉組4組大鼠凍傷皮膚組織，制作石蠟切片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察不同組別表皮厚度、血管等情況。結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，模型組表皮較厚，皮下有較多血管;水煎組及滲漉組表皮均較薄，血管明顯減少，并有毛囊出現(xiàn)，給藥后表皮腫脹消退且凍傷皮膚逐漸康復(fù)。

圖1 各組給藥后皮下組織的變化(×100)

3 討論

當(dāng)歸四逆湯溫陽(yáng)與散寒并用、養(yǎng)血與通脈兼施，諸藥相合，溫、補(bǔ)、通三者并用，溫中有補(bǔ)，補(bǔ)中兼行，一則散寒通脈，一則溫補(bǔ)營(yíng)血，使寒邪散、血脈通、陽(yáng)氣旺、營(yíng)血充，正合陽(yáng)虛血弱、寒凝血滯之病機(jī)。加味花椒，可散寒除濕，治寒濕痹痛，助當(dāng)歸四逆湯溫陽(yáng)散寒通脈之力，扶正祛邪，標(biāo)本兼顧?！秱摗分挟?dāng)歸四逆湯原方的劑量比例為當(dāng)歸∶桂枝∶芍藥∶細(xì)辛∶炙甘草∶通草為3∶3∶3∶3∶2∶2。目前，臨床上芍藥多用白芍，取白芍酸甘、滋養(yǎng)陰血之功，但在東漢時(shí)期，芍藥不分白芍、赤芍，且赤芍有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之效，故本試驗(yàn)同用白芍與赤芍。細(xì)辛辛溫行散、散寒止痛，有小毒，故臨床使用有“細(xì)辛不過(guò)錢”之說(shuō)，即不超過(guò)3 g?？紤]當(dāng)歸、桂枝、芍藥等藥的臨床常用劑量，本試驗(yàn)的處方劑量確定為當(dāng)歸 9 g，桂枝 9 g，赤芍 9 g，白芍 9 g，細(xì)辛 3 g，炙甘草 6 g，通草6 g，大棗 9 g，花椒 6 g。

現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸四逆湯灌胃對(duì)酒石酸銻鉀所致小鼠扭體反應(yīng)和電刺激致痛嘶叫反應(yīng)均有顯著抑制作用，對(duì)巴豆油所致小鼠耳廓腫脹和角叉萊膠所致大鼠足跖腫脹均有抗炎消腫作用[8];當(dāng)歸四逆湯還有顯著的活血化瘀作用[9]。花椒揮發(fā)油有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[10];花椒毒酚能顯著提高熱板法致痛小鼠的痛閥值，具有鎮(zhèn)痛作用[11]。因此，當(dāng)歸四逆湯和花椒均有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛及活血化瘀作用，在當(dāng)歸四逆湯基礎(chǔ)上加味花椒，功能溫中止痛、散寒除濕，更有利于凍瘡的防治。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，水煎與滲漉提取物均有利于凍傷的恢復(fù)，水煎提取物的抗炎消腫效果好于滲漉提取物，而兩者的鎮(zhèn)痛作用無(wú)明顯差異，表明當(dāng)歸四逆湯加味花椒的水溶性及脂溶性成分均有較好的鎮(zhèn)痛效果;組織切片顯示，水煎組及滲漉組給藥后皮下組織內(nèi)血管較模型組明顯減少，且滲漉組效果較顯著。因此，在當(dāng)歸四逆湯加味花椒用于防治凍瘡的藥效學(xué)研究中，應(yīng)綜合考慮水溶性和脂溶性成分的協(xié)同作用，還應(yīng)進(jìn)一步考察給藥后血液流變學(xué)特性，即檢測(cè)全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞變形指數(shù)等指標(biāo)的變化。

致謝:本文的試驗(yàn)研究工作得到了上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的黃景斌、郭春榮、浦益瓊等老師的悉心指導(dǎo)和熱忱幫助，在此謹(jǐn)致謝意。

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