李曉飛 譚小力 李俊 武玉花 曹應龍

水稻是人類的主要糧食作物之一，自從1988年，Toriyama培育了第一個轉基因水稻，它就一直是現(xiàn)代農業(yè)生物技術領域轉基因研究的熱點，改良的性狀涉及抗病、抗蟲、抗旱、耐除草劑、營養(yǎng)高效及品質改良［1-3］。鑒于轉基因作物在生態(tài)安全及食用安全方面存在潛在的風險，雖然在水稻的遺傳改良方面已取得很大成績，但由于水稻是人們的重要食糧，世界各國對轉基因水稻的商業(yè)化都持審慎的態(tài)度。2012年，全球28個國家種植了25 種轉基因作物，涉及319個轉化體，種植面積達17億hm2，產生了巨大的經濟效益［4］。

目 前， 在 ISAAA數(shù) 據 庫（http：//www.isaaa.org/inbrief/default.asp）中只檢索到7個獲準商業(yè)化的水稻品種，包括日本研發(fā)的7Crp#10，中國研發(fā)的汕優(yōu)63 和華恢1號/TT51-1，拜耳作物科學公司研發(fā)的LLRICE06、LLRICE601和LLRICE62，以及伊朗研發(fā)的Tarommolaii + cry1Ab。我國在轉基因水稻領域的研究也非?；钴S，目前已有超過100個轉基因水稻品系進入田間試驗［5］。其中，抗蟲水稻華恢1號和汕優(yōu)63兩種轉基因抗蟲水稻已獲得農業(yè)部頒發(fā)的生產應用安全證書［6］。在我國除了華恢1號/TT51-1具有良好的應用前景，其他兩個抗蟲水稻科豐6號和克螟稻也具有很好的應用潛力。TT51-1（轉基因Bt63）是華中農業(yè)大學研發(fā)，含有由水稻Actin 1啟動子和NOS終止子調控表達的Cry1Ab/Ac 融合基因，高抗螟蟲及鱗翅目昆蟲［7-9］?？嗣臼怯烧憬髮W原子核農業(yè)科學研究所運用農桿菌介導法將密碼子經優(yōu)化的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thurienglensis，簡稱Bt）殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab 導入水稻中培育而成，高抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等水稻害蟲［10］。科豐6 號由中國科學院遺傳與發(fā)育研究所和福建省農業(yè)科學院合作培育［11］，含有Cry1Ac 基因、CpTi 基因與選擇標記HPT 基因（潮霉素抗性基因），對水稻害蟲二化螟和稻縱卷葉螟高抗［12，13］。隨著田間試驗頻次的不斷升高，處于試驗階段的轉基因材料容易混雜到非轉基因品種中，影響食物鏈的安全?？瓜x水稻TT51-1在獲準安全證書之前，曾意外混雜到米粉等食品中，并在中國、香港及歐洲等地的市場上被檢出。只在美國獲準商業(yè)化的耐除草劑水稻LLRICE601 也曾在歐盟進口的米制品中被檢出。近幾年，歐盟還通報了我國出口的多批次的進口米制品（如米粉、米果和粉條等）中疑似含有科豐6 號轉基因成分（食品和飼料快速預警系統(tǒng) RASFF No.2010.0336）。為此，歐盟還曾采取緊急措施，要求所有進口的稻米及制品都要經過有資質的實驗室檢驗，確保不含有非法轉基因成分。鑒于轉基因作物的潛在風險，全球50多個國家已經要求對轉基因食品和飼料進行標識，并對食品和動物飼料的轉基因成分含量作出了相關規(guī)定。如挪威的標識閾值是2％、瑞士1％、歐盟0.9％、日本5％［14］。我國也頒發(fā)了《轉基因生物安全管理條例》和《農業(yè)轉基因生物標識管理辦法》等法規(guī)，要求對轉基因產品實施標識管理。管理法規(guī)及標識制度的落實依賴可靠的轉基因檢測方法及檢測結果［15］。在轉基因產品檢測過程中，陽性對照或標準物質是必不可少的物質基礎。目前，包括TT51-1、科豐6號和克螟稻在轉基因水稻都未正式商業(yè)化種植，在轉基因檢測過程中很難獲取到可靠來源的轉基因水稻陽性材料作為陽性對照，影響檢測工作的開展。

為了解決轉基因檢測標準物質匱乏的難題，檢測人員著手研制不受轉基因原材料限制的陽性質粒分子，作為替代性標準物質，應用于轉基因檢測。目前已報道的陽性質粒標準分子有GTS40-3-2［16］、MON1445、MON531［17］、MON810［18］、MON863［19］、NK603［20］、Bt11［21］和 TT51-1［22］等。本研究旨在構建一種適用于轉基因水稻篩查檢測及TT51-1、科豐6號和克螟稻1事件特異性檢測的陽性質粒分子，解決轉基因水稻安全監(jiān)管工作中缺乏標準物質的難題，為轉基因安全監(jiān)管和執(zhí)法提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

非轉基因水稻珍汕97和非轉基因水稻明恢63由本實驗室保存，轉基因水稻TT51-1、克螟稻（KMD1）、 科 豐 6號（KF-6） 和 轉 基 因 油 菜MS8×RF3的種子粉末由農業(yè)部科技發(fā)展中心提供，轉基因成分的含量均為1％。轉基因水稻TT51-1用于克隆TT51-1的事件特異性序列；科豐6號用于克隆CaMV35S啟動子、NOS終止子、HPT基因和科豐6號事件特異性序列；克螟稻用于克隆NPTⅡ基因和克螟稻事件特異性序列；轉基因油菜MS8×RF3用于克隆Bar基因。

1.2 方法

1.2.1 植物基因組DNA 用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit（No.69104）試劑盒提取種子粉末的基因組DNA。提取的DNA用超微量分光光度計NanoDrop 2000（Thermo，USA）檢測純度和濃度。

1.2.2 基因元件克隆 在GenBank數(shù)據庫中檢索各元件的核苷酸序列信息，各基因元件的登錄號詳見表1，參閱國標中各基因元件的檢測引物，并確定檢測引物在基因序列中的位置。利用生物軟件Primer Premier 5 在各基因元件檢測引物的外側設計克隆引物（表1）。 在 C1000TMPCR 儀（Bio-Rad）上進行PCR擴增，PCR 擴增體系50μL，含有：1×KOD Plus buffer，MgSO41mmol/L，每種dNTP0.2mmol/L，基因組DNA 1μL，高保真酶KOD Plus 1 U，上下游引物分別0.25μmol/L。擴增程序：94℃ 2min；94℃30s，68℃ 60s，35 個循環(huán)；68℃ 2min 后停止。取8μL PCR 產物在1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。將擴增片段連接于pZero-AMP 克隆載體，轉化大腸

桿菌Top10，挑取單克隆測序驗證后提取質粒備用。

表1 轉基因元件克隆引物序列信息

1.2.3 重疊延伸 PCR 及陽性質粒載體構建 應用重疊延伸PCR 技術，將克隆到的KMD1、KF-6、TT51-1、CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bar基因、HPT基因序列和NPTⅡ基因序列共8 個片段分別兩兩拼接，先獲得4個片段。再把這4個片段兩兩拼接得到2 個大片段，最后將2個大片段拼接成一個重組的大分子。每一次將兩個片段拼接時，需兩輪PCR反應。兩次使用同一PCR擴增體系，程序設為：94℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 1min（拼接時隨著PCR 產物長度增加，延伸時間也相應延長），20個循環(huán)；68℃ 2min后停止反應。但兩輪PCR反應所用模板和引物均不同。例如：片段1與2拼接時，分別先進行第一輪反應，以帶有各自目的片段的質粒作模板，片段1的5'端引物使用載體上的M13F（-47）/M13R（-48），3'端引物使用基因本身內部的引物；而片段2正好相反，5'端使用基因引物，3'端使用載體上的M13F（-47）/M13R（-48），擴增28個循環(huán)后，得到兩段PCR產物，并且之間有一段序列相同的重疊區(qū)域。第二輪反應再以上一輪PCR產物的混合物作模板，分別加入上述產物0.25μL進行反應。兩輪PCR反應使用引物不同，是為了避免第一輪反應中生成引物二聚體或非特異性擴增產物影響第二輪的擴增的效果。最后將拼接好的2 998bp大分子先用T4多核苷酸激酶磷酸化，然后通過平端連接的方式克隆至載體pBS Inter+的EcoRⅤ位點上，然后將單獨克隆到的SPS基因片段通過SacⅠ酶切，也連接到同一載體上，并將構建好的陽性載體命名為 pBS Rice（圖1）。

1.2.4 定性檢測PCR 應用國標中的檢測引物、反應體系和反應程序，用構建的陽性質粒作為對照，用轉基因水稻TT51-1、KMD1、KF-6和非轉基因水稻明恢63作為樣品進行驗證，考察陽性質粒分子在檢測中的適用性。各基因元件的篩查檢測引物及擴增產物大小詳見表2。CaMV35S啟動子和NOS終止子的反應體系和反應程序詳見農業(yè)部1782號公告-3-2012，NPTⅡ和HPT基因的反應體系和反應程序詳見農業(yè)部1782號公告-2-2012，Bar基因的反應體系和反應程序詳見農業(yè)部1782號公告-6-2012，TT51-1、KMD1和KF-6的反應體系和反應程序參閱農業(yè)部1193號公告-3-2009。

圖1 陽性質粒分子pBS Rice的載體結構圖譜

2 結果

2.1 確定轉基因水稻的檢測靶標

檢索美國ISAAA數(shù)據庫，目前獲準商業(yè)化的轉基因水稻品種有7個，但是ISAAA數(shù)據庫并沒有提供這7個轉基因品種的詳細遺傳轉化信息。其中汕優(yōu)63和TT51-1均為我國的華中農業(yè)大學培育，而且汕優(yōu)63是以華恢1號作為親本培育的雜交種，因此實際上汕優(yōu)63和TT51-1含有相同的轉化事件。檢索加拿大AGBIOS公司轉基因作物數(shù)據庫（http：//www.agbios.com/dbase.php）， 只 檢 索 到拜耳作物科學公司培育的耐除草劑水稻LLRICE06、LLRICE62、LLRICE601。LLRICE06和 LLRICE62中是通過基因槍法轉入了相同的載體，含有Bar基因、CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子；LLRICE601中是通過農桿菌介導法轉入了Bar基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子。統(tǒng)計獲取到遺傳轉化信息的轉基因水稻品種，根據各基因元件的使用頻率（表3），結合水稻基因工程研究中常用的標記基因，選擇CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因作為轉基因水稻篩查檢測的靶標。同時聚合構建TT51-1、KMD1和KF-6的事件特異性序列，便于對轉基因水稻進行身份鑒定。利用這些檢測靶標對目前已知遺傳轉化信息的轉基因水稻的篩查覆蓋率是100％，同時CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因是基因工程研究中最常用的調控元件和標記基因，通過檢測這些元件，對處于田間試驗階段的轉基因水稻材料也具有良好的篩查效果。

表2 用于轉基因水稻篩查檢測的引物

表3 轉化事件的基因元件信息矩陣

2.2 陽性質粒分子的構建

用表1中的引物分別擴增各檢測靶標。以TT51-1基因組DNA為模板擴增出了337bp的TT51-1事件特異性序列、295bp的SPS基因序列（圖2-E）；以KF-6的基因組DNA為模板擴增出了282bp的CaMV35S啟動子、570bp的HPT基因、256bp NOS終止子、378bp的KF-6事件特異性序列；以KMD1基因組DNA為模板，擴增出380bp的NPTⅡ基因、440bp的KMD1事件特異性序列；以MS8×RF3的基因組DNA為模板，擴增出了355bp的Bar基因（圖2-A）。測序后將克隆序列與GenBank數(shù)據庫中的序列進行比對，選擇無錯配堿基的克隆用于下一步試驗。同時將各基因元件的擴增序列與國標中的檢測序列進行比對，發(fā)現(xiàn)各基因元件的擴增序列均包含了國標中的檢測片段。

采用重疊延伸PCR技術，先分別將克隆到的KMD1事件特異性序列和KF-6事件特異性序列、TT51-1事件特異性序列和CaMV35S啟動子、NOS終止子和Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因序列分別兩兩拼接，得到4個拼接片段，長度約在600-1000bp（圖2-B）；再將這4個片段兩兩連接，形成2個較大片段，約1500bp（圖2-C）；最后將2個較大片段連成一個完整的長度為2998bp 的大分子序列（圖2-D）。將該片段通過平端連接的方式連接到pBS Inter+載體上。然后將克隆的水稻內標基因SPS（圖2-E）通過用SacⅠ單酶切的方式插入到pBS Inter+載體中，構建成水稻轉基因檢測用的陽性質粒分子，并命名為pBS Rice（圖1）。以pBS Rice質粒為模板，分別用引物組合KMD1-F/NPTⅡ-R和SPS-F/SPS-R進行PCR擴增，并測序驗證后發(fā)現(xiàn)擴增序列與預期大小的片段一致。結果表明構建的轉基因水稻檢測用質粒分子包含了水稻SPS內標基因及正確的8個檢測靶標。

2.3 陽性質粒分子的應用

圖2 基因擴增和重組PCR拼接過程

使用表2中各基因元件的篩查檢測引物，以本研究構建的陽性質粒分子pBS Rice作為陽性對照，以非轉基因水稻珍汕97做陰性對照，分別以轉基因水稻TT51-1、KF-6、KMD1、非轉基因水稻明恢63作為樣品，進行PCR擴增，考察轉基因水稻檢測用陽性質粒分子pBS Rice在實際檢測工作中的適用性。定性PCR結果（圖3）顯示，SPS基因在陽性質粒分子和所有水稻樣品中均有預期擴增產物；8對檢測引物在質粒分子pBS Rice和含有相應靶標的樣品中均有預期擴增產物。如CaMV35S啟動子在質粒分子、KF-6和KMD1中均有預期擴增產物，在陰性對照、TT51-1和明恢63中沒有擴增；Bar基因只在質粒分子中有擴增，其他樣品中無擴增；TT51-1特征序列只在質粒分子和TT51-1樣品中有擴增，其他樣品中沒有擴增。 擴增結果表明，本研究構建的質粒分子pBS Rice在轉基因水稻檢測中可以代替轉基因水稻原材料作為陽性對照，適用于轉基因水稻的篩查檢測和TT51-1、KF-6、KMD1的事件特異性檢測，具有良好的適用性和可替代性。

圖3 陽性質粒作為對照篩查轉基因作物檢測圖譜

3 討論

由于生物技術產業(yè)迅速發(fā)展，轉基因作物田間試驗的頻次也在不斷攀升，至2009年，我國有記錄的田間試驗達4000多次，其中水稻有480余次。我國的水稻基礎研究及轉基因研究都位居世界的前列，水稻又是我國的主糧，其安全與國家的糧食安全息息相關，因此對轉基因水稻的安全監(jiān)管形勢尤其嚴峻。近年來，我國也不斷完善轉基因植物及其產品檢測標準體系，包括事件特異性檢測標準和篩查檢測標準。但檢測機構在執(zhí)行標準的過程中，經常遇到無適合的標準物質可用的難題，尤其是進行篩查檢測時，通常用混合的轉基因材料作為對照，有時會影響檢測結果的判定。從實際檢測需求出發(fā)，我們統(tǒng)計分析了目前能獲知遺傳轉化信息的轉基因水稻中調控元件和功能基因的種類及使用頻率。

在水稻的抗蟲改良中，經常會用蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白（Bt）基因，Bt基因種類很多，目前已在轉基因作物中應用的Bt基因有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A105、Cry1F、Cry2Ab、Cry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1和Cry9c等，基因間的序列差異很大。在實際應用中，為了增強晶體蛋白的殺蟲性，經常會對Bt基因的密碼子進行修飾，如KMD1中的Cry1Ab基因。在轉基因檢測中，無法設計出通用引物檢測所有Bt基因，因此本研究沒有將Bt基因作為轉基因水稻篩查檢測的靶標。根據轉基因水稻中基因元件的使用頻率，結合水稻基因工程研究中標記基因的實際應用情況，確定將CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因作為轉基因水稻篩查檢測的靶標。

將水稻內標基因SPS、篩選靶標（CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bar基因、HPT基因和NPTⅡ基因）、事件特異性檢測靶標（TT51-1、KF-6、KMD1）聚合克隆到質粒載體上，構建質粒分子pBS Rice。利用質粒分子pBS Rice作為陽性對照，可以對轉基因水稻進行篩查檢測。若檢測結果為陽性，可進一步利用質粒分子pBS Rice作為陽性對照，對陽性樣品進行身份鑒定。若陽性樣品的身份不是TT51-1、KF-6或KMD1，則可判定處于研發(fā)階段的轉基因水稻非法流散到了市場上。應用結果表明，陽性質粒分子pBS Rice既適用于轉基因水稻的篩查檢測，也適用于抗蟲水稻TT51-1、KF-6和KMD1的事件特異性檢測，本研究提供了一種不依賴于轉基因水稻陽性原材料供應的安全監(jiān)管轉基因水稻檢測用陽性對照。

4 結論

通過分析國內外轉基因水稻材料的分子特性及轉化元件，構建了一個適于轉基因水稻篩查檢測和身份鑒定的陽性質粒分子，該質粒分子不需依賴于轉基因水稻原材料的供應，解決了轉基因水稻安全監(jiān)管工作中缺乏陽性對照的難題。

［1］ Toriyama K, Arimotoa Y, Uchimiyaa H, et al.Transgenic rice plants after direct gene transfer into protoplasts ［J］.Nature Biotechnology,1988, 6：1072-1074.

［2］ Zhang HM, Yang H, Rech EL, et al.Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts ［J］.Plant Cell Reports, 1988, 7：379-384.

［3］ Zhang W, Wu R.Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign gene in the plants ［J］.Theor Appl Genet, 1988, 76：835-840.

［4］ James C.Global Status of Commercia-lized Biotech/GM Crops ［M］.Ibercaja, Spain：The International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications, 2012.

［5］ Shu QY, Ye GY, Cui HR, et al.Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis werehighly resistant to eight lepidopteran rice pest species ［J］.Molecular Breeding, 2000, 6：433-439.

［6］ Lu CM.The first approved transgenic rice in China ［J］.Genetically Modified Crops, 2010, 1：113-115.

［7］ Tu J, Datta K, Alam MF, et al.Expression and function of ahybrid Bt toxin gene in transgenic rice conferring resistance to insect pests ［J］.Plant Biotechnology, 1998, 15（4）：195-203.

［8］ Tu J, Zhang GA, Datta K, et al.Field performance of transgenic elite commercialhybrid rice expressing Bacillus thuringiensis dendotoxin［J］.Nature Biotechnology, 2000, 18：1101-1104.

［9］ Tu J, Datta K, Oliva N, et al.Site-independently integrated transgenes in the elite restorer rice line Minghui 63 allow removal of a selectablemarker from the gene of interest by self-segregation ［J］.Plant Biotechnology Journal, 2003, 1：155-165.

［10］ 舒慶堯, 葉恭銀, 崔海瑞, 等.轉基因水稻”克螟稻”選育［J］.浙江農業(yè)大學學報, 1998, 24（6）：579-580.

［11］ Rong J, Song ZP, Su J, et al.Low frequencies of transgene flow between Bt/CpTI rice and their nontransgenic counterparts under alternating cultivation ［J］.Biodivers Sci, 2006, 14：309-314.

［12］ 李冬虎, 傅強, 王鋒, 等.轉sck/cry1Ac雙基因抗蟲水稻對二化螟和稻縱卷葉螟的抗蟲效果［J］.中國水稻科學, 2004, 18（1）：43-47.

［13］ 趙紅盈, 張永軍, 吳孔明, 等.轉cryAc/CpTI雙價抗蟲水稻cry1Ac殺蟲蛋白的表達特性及其對二化螟的毒殺效果［J］.農業(yè)生物技術學報, 2004, 12：76-79.

［14］ Marta H, Adolfo R, Teresa E, et al.A rapeseed-specific gene,acetyl-CoA carboxylase, can be used as a reference for qualitative and Real-Time quantitative PCR detection of transgenes frommixed food samples ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001, 49（8）：3622-3627.

［15］ 李飛武, 李蔥蔥, 邢珍娟, 等.抗草甘膦系事件特異性定量PCR檢測方法的建立［J］.大豆科學, 2009, 28（2）：296-300.

［16］ Lievens A, Bellocchi G, De BD, et al.Use of pJANUS02-001 as a calibrator plasmid for Roundup Ready soybean event GTS40-3-2detection：an interlaboratory trial assessment ［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 396（6）：2165-2173.

［17］ Yang LT, Pan AH, Zhang KW, et al.Qualitative and quantitative PCRmethods for event-specific detection of geneticallymodified cotton Mon1445 and Mon531 ［J］.Transgenic Research, 2005, 14（6）：817-831.

［18］ Hernandez M, Pla M, Esteve T, et al.A specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 inmaize Yield Gard based on the 3￠ -transgene integration sequence ［J］.Transgenic Research, 2003, 12（2）：179-189.

［19］ Lee SH, Min DM, Kim JK.Qualitative and quantitative polymerase chain reaction analysis for geneticallymodifiedmaize MON863 ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54：1124-1129.

［20］ Nielsen CR, Berdal KG, Holst-Jensen A.Characterization of the 5 integration site and development of an event-specific real-time PCR assay for NK603maize from a low starting copy number ［J］.European Food Research and Technology, 2004, 219：421-427.

［21］ Made D, Degner C, Grohmann L.Detection of geneticallymodified rice：a construct-specific real-time PCRmethod based on DNA sequences from transgenic Bt rice ［J］.European food Research and Technology, 2006, 224：271-278.

［22］ Wu G, Wu YH, Nie SJ, et al.Real-time PCRmethod for detection of the transgenic rice event TT51-1 ［J］.Food Chemistry, 2010,119（1）：417-422.