薛沖沖 張俊輝 林影 韓雙艷

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），指一系列能在油-水界面水解三酯酰甘油的酶類(lèi)。其中米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucormiehei lipase，RML）是一種重要的、有代表性的脂肪酶，它可以催化酯水解、酯合成、酸解、醇解、氨解、內(nèi)酯化、轉(zhuǎn)酯化等多種類(lèi)型的反應(yīng)［1］。由于RML具有獨(dú)特的催化結(jié)構(gòu)，并且能顯示高度的底物1，3位置專(zhuān)一性［2］，使其相對(duì)于其他一些工業(yè)脂肪酶，如南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）具有更好的底物選擇性和特異性。因此其在油脂、制藥、香精香料、化工等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值［3］。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有可進(jìn)行高密度發(fā)酵、表達(dá)量較高、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、糖基化程度低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用該系統(tǒng)成功地表達(dá)了大量的外源蛋白［4，5］。本實(shí)驗(yàn)室也將RML在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，但是其表達(dá)量比較低，造成生產(chǎn)成本較高，和商業(yè)化酶相比仍有較大的差距。因此有必要提高RML在畢赤酵母中的表達(dá)水平，降低其成本和價(jià)格，促進(jìn)其工業(yè)化大規(guī)模使用。

2004年 Ahn等［8］將來(lái)源于哈茨木霉內(nèi)切葡聚糖酶II（THEGII）的CBD與嗜熱脂肪芽孢桿菌的L1脂肪酶在釀酒酵母中融合表達(dá)，融合蛋白CBDLinker-L1Lipase相比較L1-Lipase的分泌量會(huì)顯著提高7倍。故本研究嘗試通過(guò)該CBD與RML在畢赤酵母中進(jìn)行高效的融合表達(dá)，以期獲得高酶活力的RML，為進(jìn)一步的降低應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的RML的生產(chǎn)成本，有目的改善RML的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Pichia pastoris GS115、菌株E.coli Top10F'由本實(shí)驗(yàn)室保存，重組質(zhì)粒pPICZαA-RML由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、pUC57-CBD-L由金斯瑞生物科技有限公司合成，質(zhì)粒 pPICZαA 購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化鈉，根據(jù)需要添加100mg/mL博來(lái)霉素，終濃度為25μg/mL。培養(yǎng)基YPD、 MD、BMGY、 BMMY配方參考Invitrogen公司操作手冊(cè)。

1.1.3 試劑 酵母氮源YNB（Yeast Nitrogen Base）、蛋白胨均購(gòu)Difco公司；酵母抽提物購(gòu)自O(shè)xford公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 為了獲得相應(yīng)的目的基因片段 CBD和RML需設(shè)計(jì)特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增。其中擴(kuò)增來(lái)源于 THEGII的目的片段 CBD 使用模板pUC7-CBD，上游引物 CBDp1：CCGGAATTCCAGCAGACAGTTTG，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)（以下劃線示出）及保護(hù)堿基；下游引物 CBDp2：ATAACCGCGGTGATGAGGTTG，含 Sac II 酶切位點(diǎn)（以下劃線示出）及保護(hù)堿基。擴(kuò)增RML基因使用模板 pPICZαARML，上游引物 RMLp1：ATAACCGCGGGTTCCAATTAAGAGACAAT，含Sac II 酶切位點(diǎn)（以下劃線示出）及保護(hù)堿基；下游引物RMLp2：ATTATTGCGGCCGCTAGTACACAAACCAGT，含Not I 酶切位點(diǎn)（以下劃線示出）及保護(hù)堿基。引物合成由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

1.2.2 CBD-RML的克隆 以pUC7-CBD為模板，CBDp1和CBDp2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段CBD，反應(yīng)體系為模板 1μL；primerstar HS為 25μL；20mmol/L 的上下游引物各 1μL，加無(wú)菌水至總體積為 50μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性 5min；98℃變性 15s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，共25 個(gè)循環(huán)；第25 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。同理，以pPICZαA-RML為模板，RMLp1和RMLp2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段RML，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收純化。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPICZαA-CBD-RML（簡(jiǎn)稱“pPICZ-αA-CRML”）的構(gòu)建 當(dāng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαACRML時(shí)，將PCR產(chǎn)物CBD用EcoR I和Sac II雙酶切，RML用Sac II和Not I雙酶切，同時(shí)將質(zhì)粒pPICZαA用EcoR I和Not I雙酶切，在T4連接酶的作用下構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-CRML，然后用 CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入 Top10F'，在 Zeocin+的 LB（25μg/mL）平板上涂板，過(guò)夜培養(yǎng)。提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，對(duì)pPICZαA-CRML進(jìn)行EcoR I和Not I 雙酶切鑒定；鑒定正確后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組畢赤酵母的構(gòu)建 通過(guò) LiCl 法將Sac I 線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA-CRML轉(zhuǎn)化宿主菌GS115轉(zhuǎn)化物涂布于YPDS（Zeocin+）平板上，30℃培養(yǎng)2-3d。

我國(guó)確立和推進(jìn)社會(huì)主義市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)以來(lái)，中央和地方政府的經(jīng)濟(jì)立法始有成效，但對(duì)保護(hù)支持中小企業(yè)的立法仍有欠缺。2002年我國(guó)發(fā)布《中小企業(yè)促進(jìn)法》，啟動(dòng)了保護(hù)支持中小企業(yè)發(fā)展的立法。2017年第十二屆全國(guó)人民代表大會(huì)常務(wù)委員會(huì)第29次會(huì)議修訂通過(guò)《中小企業(yè)促進(jìn)法》，從2018年1月1日起開(kāi)始實(shí)施。修訂后的《中小企業(yè)促進(jìn)法》著力解決中小企業(yè)負(fù)擔(dān)重、融資難和人才缺乏等具體問(wèn)題，使保護(hù)支持中小企業(yè)健康發(fā)展的法律作用上了一個(gè)新臺(tái)階。但除了全國(guó)人大的立法，地方人大因地制宜的立法也是不可或缺的。由于地方政府受財(cái)力物力或其他因素制約，對(duì)地方立法支持小微企業(yè)缺乏主動(dòng)性，以至這方面的立法比較滯后。

1.2.5 畢赤酵母重組菌株產(chǎn)重組米黑根毛霉脂肪酶酶的水解平板檢測(cè) 挑取在 YPDS（Zeocin+）平板上正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到MD平板上，30℃培養(yǎng) 2-3d。然后挑取水解圈較大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.6 重組轉(zhuǎn)化子的鑒定及搖瓶培養(yǎng) 經(jīng)過(guò)水解平板篩選后，從MD平板上挑取水解圈較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并命名為GS115/pPICZαACRML；同時(shí)以重組菌GS115/pPICZαA-RML為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

將不同菌株分別接種于 25mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，250r/min 振蕩培養(yǎng)約 40h 至 OD600到 25-30。離心收集菌體，再將其懸浮于 25mL BMMY 培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h 向 BMMY 培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為2.0％進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2.7 重組脂肪酶的酶活測(cè)定 以對(duì)硝基苯基辛酸酯最為重組脂肪酶CR和RML的最適底物，利用pNPC法測(cè)定發(fā)酵上清液中脂肪酶的活力［9］。酶活單位（U）定義為：每分鐘水解底物生成1μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.2.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析 重組轉(zhuǎn)化子GS115/pPICZαA-CRML 和 對(duì) 照 菌 GS115/pPICZαARML誘導(dǎo)培養(yǎng) 120h，取發(fā)酵上清液 50μL，以 20μL 上樣，進(jìn)行 12％ SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)R250 染色，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pPICZαA-CRML的構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-CRML，經(jīng)雙酶切鑒定（圖1）顯示目的片段大小約為1200bp（含210bp前導(dǎo)肽序列），重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示插入片段大小為1233bp，與擬克隆的CRML序列一致，且讀碼框正確。

2.2 重組轉(zhuǎn)化子的三丁酸甘油酯MM平板鑒定篩選

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，所獲得的重組轉(zhuǎn)化子接種于 MM平板（混合三丁酸甘油脂），倒置培養(yǎng)皿，在蓋上涂 100μL甲醇，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng) 72h后，重組轉(zhuǎn)化子相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照菌GS115/pPICZαA-RML，在菌落周?chē)墚a(chǎn)生較大的透明圈，說(shuō)明重組轉(zhuǎn)化子能夠有效地分泌脂肪酶，圖2所示為MM平板上其中一個(gè)重組轉(zhuǎn)化子（GS115/pPICZαA-CRML）和陽(yáng)性對(duì)照菌（GS115/pPICZαARML）的水解圈比較，GS115/pPICZαA-CRML周?chē)乃馊σ黠@大于GS115/pPICZαA-RML。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA-CRML的雙酶切鑒定

圖2 三丁酸甘油酯 MM板檢測(cè)酵母重組菌

2.3 CBD-RML 和RML在畢赤酵母中的表達(dá)

將篩選獲得的重組酵母和對(duì)照菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，添加終濃度2％的甲醇誘導(dǎo)，每隔24h取樣，檢測(cè)重組酶酶活力和OD600值，結(jié)果（圖3，圖4）表明，在甲醇誘導(dǎo)的120h期間，GS115/pPICZαA-RML的生長(zhǎng)狀況明顯好于重組菌GS115/pPICZαA-CRML，可能是由于外源基因的加入，宿主菌表達(dá)新基因需要消耗更多的資源，導(dǎo)致宿主菌代謝負(fù)擔(dān)增加，從而影響重組菌的生長(zhǎng)。當(dāng)整合哈茨木霉的CBD到RML的N-末端后，重組酶CRML的酶活力整體比RML要高，甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶96h時(shí)，CRML相對(duì)RML酶活提高了近16.7％，分析可能是CBD的加入提高了融合蛋白的分泌量。

當(dāng)甲醇誘導(dǎo)120h時(shí)，分別取以上發(fā)酵上清液20μL上樣進(jìn)行10％ SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果（圖5）顯示，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，整合有CBD的重組脂肪酶CRML分子質(zhì)量要略高于RML（30kD），而且重組酶CRML蛋白濃度要明顯高于RML，與發(fā)酵數(shù)據(jù)基本一致，即因?yàn)镃BD整合到RML中，導(dǎo)致重組酶CRML的分泌量提高，進(jìn)而在SDS-PAGE分析結(jié)果顯示出重組酶CRML的蛋白條帶濃度高于RML的現(xiàn)象。

圖3 兩種重組畢赤酵母的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線

圖4 兩種重組畢赤酵母產(chǎn)酶曲線

圖5 兩種重組酵母發(fā)酵上清液的SDS-PAGE

2.4 CRML 和RML的酶學(xué)性質(zhì)

在 pH值 8.0的磷酸緩沖液中配制底物，分別在不同反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，在 30-60℃內(nèi)溫度曲線見(jiàn)圖 6。由圖6可知，RML在45℃時(shí)酶活力最高，而重組脂肪酶CRML的最適溫度為50℃，并且在45-60℃范圍內(nèi)均有超過(guò)60％的酶活力。

酶的熱穩(wěn)定測(cè)定時(shí)，將酶置于65℃時(shí)保溫，每隔2min取樣測(cè)酶活力，并繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線，由圖7可知，兩者酶的熱穩(wěn)定性曲線基本類(lèi)似，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)兩者的熱穩(wěn)定性逐漸下降，反應(yīng)到第8min時(shí)，CRML的相對(duì)酶活力降到僅剩7.5％，而RML的相對(duì)酶活力也只剩11％。

3 討論

當(dāng)前，微生物脂肪酶至投入工業(yè)生產(chǎn)20多年來(lái)，其應(yīng)用領(lǐng)域相當(dāng)廣泛，包括食品工藝、造紙業(yè)、精細(xì)化學(xué)品合成業(yè)、化妝品制造業(yè)和制藥等行業(yè)中，一直是酶學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，米黑根毛霉脂肪酶RML正是這樣一種在各行業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的酶，但是關(guān)于對(duì)RML酶活改進(jìn)的文章報(bào)道還比較少，Zhang等［10］嘗試將RML在釀酒酵母表面進(jìn)行展示表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其酶活力比較低，只有280U/L。但在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中，RML的應(yīng)用出現(xiàn)了急需解決的兩個(gè)主要問(wèn)題：第一，較高的成本投入；第二，酶的穩(wěn)定性和酶活力較差。

CBD在蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用是個(gè)新的領(lǐng)域，許多研究表明當(dāng)將CBD與異源蛋白融合表達(dá)時(shí)，大部分可以提高融合蛋白的表達(dá)量。Johanna等［11］研究了CALB和融合CBD（CBM第一家族）的CALB在以甲醇為誘導(dǎo)的畢赤酵母中功能性的表達(dá)，該CBD來(lái)自于厭氧性瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的纖維素酶A。研究結(jié)果顯示，分泌到培養(yǎng)基的重組蛋白（CBD-CALB）水平近25mg/L，CBD-CALB和CALB相比有相似的比活力，且CBD-CALB吸附纖維素的能力遠(yuǎn)大于CALB。Sarath等［12］將來(lái)源于里氏木霉纖維二糖水解酶（CBHII）的CBD（CBM第二家族）融合到Saccharomycopsis Wbuligera的β-葡糖糖苷酶（BGL1）中并以釀酒酵母作為表達(dá)宿主菌，結(jié)果表明，整合CBD的融合蛋白對(duì)纖維素的水解能力提高了2-4倍，其中融合一個(gè)CBD的蛋白比融合兩個(gè)CBD蛋白水解纖維素能力更強(qiáng)。另外Ahn等［8］將THEGII的CBD（CBM第一家族）與嗜熱脂肪芽孢桿菌的L1脂肪酶在釀酒酵母中融合表達(dá)后，相比較L1-Lipase，融合蛋白CBD-Linker-L1Lipase的分泌量會(huì)顯著提高7倍。本研究通過(guò)將THEGII的CBD融合到RML上后，融合蛋白CRML的表達(dá)量也有一定程度的提高，達(dá)到17％。該CBD能促進(jìn)異源蛋白表達(dá)量的提高可能原因是CBD含有異源蛋白不具有的二硫鍵結(jié)構(gòu)，而這種二硫鍵結(jié)構(gòu)有助于融合蛋白穩(wěn)定性的提高，從而阻止因與一些硫醇氧化還原酶的接觸導(dǎo)致融合蛋白聚沉［8］。本研究中的融合蛋白CRML酶活力相比較單一的RML卻只提高了17％，這可能與不同的融合酶在不同的宿主菌中表達(dá)有關(guān)系。

圖6 溫度對(duì)重組脂肪酶CRML和RML的酶活影響

圖7 重組脂肪酶CRML和RML的熱穩(wěn)定性測(cè)定（65oC）

另外，融合蛋白CRML相比較RML，其最適溫度提高了5℃，并且兩者具有相似的熱穩(wěn)定性曲線。為了滿足苛刻的工業(yè)生產(chǎn)條件，研究了65℃ 時(shí)兩種酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果表明CRML和RML在保溫2min中后，兩者相對(duì)酶活均下降超過(guò)50％，說(shuō)明如何能提高RML的熱穩(wěn)定性也是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。在相關(guān)報(bào)道中，Ravalason等［13］將來(lái)源于黑曲霉纖維二糖水解酶的第一家族CBM融合到Pycnoporus cinnabarinus的漆酶上后，融合蛋白的最適溫度相對(duì)于原始漆酶有一定程度的提高，但熱穩(wěn)定性卻有所下降；Shin等［14］通過(guò)將 Clostridium stercorarium 木聚糖酶中的木聚糖結(jié)合域從催化域的N-末端轉(zhuǎn)移到C-末端，改造后重組酶的最適溫度下降了35℃。當(dāng)增加CBM融合到不同的水解酶上后，能夠引起這些水解酶的最適溫度或熱穩(wěn)定性的各種改變，因此，很難去預(yù)測(cè)CBM的加入會(huì)對(duì)某種酶的最適溫度或熱穩(wěn)定性的絕對(duì)變化。

基于米黑根毛霉脂肪酶RML的低酶活力，生產(chǎn)高成本等缺陷，并在食品、化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景，本研究嘗試將來(lái)源于哈茨木霉的CBD整合到RML的N端并在畢赤酵母中高效表達(dá)，相比單一的RML，重組酶的酶活力最高提高了17％。獲得的高活力重組脂肪酶不僅為其在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用降低成本奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為人們探究CBD如何影響RML的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了分泌型的重組質(zhì)粒pPICZαACRML，實(shí)現(xiàn)了整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶CRML在畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，同時(shí)對(duì)RML和CRML的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，RML和CRML具有相似的最適溫度和溫度穩(wěn)定性曲線，兩者的最適作用溫度分別為45℃和50℃；相比較RML，融合蛋白CRML在畢赤酵母中的表達(dá)分泌量提高了近17％，說(shuō)明來(lái)源于THEGII 的CBD可以作為異源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的分泌增強(qiáng)子。

［1］ Derewenda U, Brzozowski AM, Lawson DM, et al.Catalysis at the interface：the anatomy of a conformational change in a triglyceride lipase［J］.Biochemistry, 1992, 31：1532-1541.

［2］ Pleiss J, Fischer M, Schimid RD.Anatomy of lipase binding sites：the scissile fatty acid binding site［J］.Chemistry and Physics of Lipids, 1998, 93：67-80.

［3］ Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R.Lipase from Rhizomucormiehei as an industrial biocatalyst in chemical proce-ss［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, 2010, 64：1-22.

［4］ Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system［J］.Yeast, 2005, 22：249-270.

［5］ Cereghino JL, Cregg JM.Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Fems Microbiology Reviews, 2000, 24：45-66.

［6］ Harhangi H, Freelove A, Ubhayasekera W, et al.Cel6A, amajor exoglucanase from the cellulosome of the anaerobic fungi Piromyces sp.E2 and Piromyces equi［J］.Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 2003, 1628：30-39.

［7］ Linder M, Terri TT.The roles and function of cellulose binding domains：minireview［J］.Journal of Biotechnology, 1997, 57：15-28

［8］ Ahn JO, Choi ES, Lee HW, et al.Enhanced secretion of Bacillus stearothemophilus L1 lipase in Saccharomyces cerevisiae by translational fusion to cellulose-binding domain［J］.Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 64：833-839.

［9］ Zhang JH, Lin Y, Sun YF, et al .High-throughput screening of B factor saturationmutated Rhizomucormiehei lipase thermostability based on synthetic reaction［J］.Enzyme and Microbial Technology, 2012, 50（6-7）：325-330.

［10］ Zhang WG, Han SY, Wei DZ, et al.Functional display of Rhizomucormiehei lipase on surface of Saccharomy cescerevisiae withhigher activity and its practical properties［J］.Chemical Technology and Biotechnology, 2007, 3：329-335.

［11］ Rotticci-Mulder JC, Gustavsson M, Holmquist M, et al.Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica Lipase B and Lipase B Fused to a Cellulose-Binding Domain［J］.Protein Expression and Purification, 2001, 21：386-392.

［12］ Gundllapalli SB, Pretorius IS, Cordero Otero RR, et al.Effect of the cellulose-binding domain on the catalytic activity of a β-glucosidase from Saccharomycopsis Wbuligera［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology, 2007, 34：413-421.

［13］ Ravalason H, Asther M, Grisel S, et al.Fusion of a family 1 carbohydrate bindingmodule of Aspergillus niger to the Pycnoporus cinnabarinus laccase for efficient softwood kraft pulp biobleaching［J］.Journal of Biotechnology, 2009, 142：220-226.

［14］ Shin ES, Yang MJ, Jung KH, et al.Influence of the trans-position of the thermostabilizing domain of Clostridium thermocellum xylanase（XynX）on xylan binding and thermostabilization［J］.Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68：3496-3501.