陳 婧

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建 廈門,361000）

急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）是一種常伴有嚴(yán)重出血的急性白血病，PML/RARα融合基因是其特異的分子學(xué)標(biāo)志，檢測(cè)PML-RARα融合基因能夠協(xié)助急性早幼粒細(xì)胞白血病診斷。電化學(xué)DNA傳感技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種檢測(cè)手段，具有方便、快捷、靈敏、低廉等優(yōu)點(diǎn)。其近年新興起的多通道生物傳感芯片技術(shù)結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)一次操作多次檢測(cè)，高效快捷具有廣泛的應(yīng)用前景。

本文根據(jù)PML/RARα融合基因的堿基序列設(shè)計(jì)了莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針,并構(gòu)建了多通道電化學(xué)傳感芯片對(duì)PML/RARα 融合基因進(jìn)行了檢測(cè)，研究了其特異性、靈敏性、重現(xiàn)性等方面的性能。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑

主要試劑：以下寡核苷酸由從寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）

1.2 APL靶序列探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)，查找出 PML/RARα融合基因的融合位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)前后的堿基作為探針使用，同源比對(duì)顯示APL的特異性序列為：5‘-…-GGG GAG GCA G CCA TTG AGA CCC-…-3’

1.3 HP/MCH芯片的制備

莖環(huán)結(jié)構(gòu)（HP）的捕獲探針需要預(yù)先形成環(huán)，把HP儲(chǔ)備液用探針成環(huán)溶液配成適當(dāng)?shù)臐舛龋?℃過(guò)夜，備用。將3.2μL不同組裝密度在組裝液滴加在金電極表面上，室溫靜置2小時(shí)后，用Tris-HCl緩沖液洗去未連接的莖環(huán)探針。在已組裝HP的通道中加入在2 mM的巰基己醇（MCH）100μL，室溫密閉過(guò)夜。MCH處理后的芯片通道表面上固定了一層捕獲探針和巰基分子的混合組裝層。

1.4 與靶mRNA的雜交

用Tris-Hcl 緩沖液清洗組裝好的芯片，而后在37℃下將芯片與目標(biāo)靶mRNA雜交30分鐘。放置至室溫后，再用Tris-Hcl洗液洗去未雜交的mRNA。而后在通道中滴加100μL 0.1%BSA溶液，室溫放置一刻鐘，再次用Tris-Hcl洗液沖洗，N2氣吹干表面后添加3.2 μL 50 U/mL的avidin修飾的辣根過(guò)氧化物酶（avidin-HRP），avidin與biotin反應(yīng)后將HRP固定在芯片通道表面上。

1.5 電化學(xué)方法檢測(cè)量

在CHI660C型電化學(xué)工作站（CH Instruments Inc）和多通道自動(dòng)切換裝置（福州大學(xué)研制）上進(jìn)行電化學(xué)實(shí)驗(yàn)，多通道芯片（WEST CHESTER, PA USA）上的每個(gè)通道均含有工作電極、參比電極以及輔助電極。電化學(xué)檢測(cè)室溫下在TMB溶液和RuHex溶液中進(jìn)行，采用的電化學(xué)方法為計(jì)時(shí)電流法（I-T）、循環(huán)伏安法 (CV)及計(jì)時(shí)電量法（CC）。

2 結(jié)果與討論

2.1 HP探針的堿基多態(tài)性研究

用電流-時(shí)間曲線（i-t）來(lái)研究探針修飾的電化學(xué)DNA多通道傳感芯片的特異性。結(jié)果如圖1所示，圖1A-1為HP與不同序列雜交后的i-t曲線。圖中曲線由f到a依次為HP探針與空白的緩沖溶液（background）、完全不匹配的mRNA、PML-mRNA、100 nM RARα -mRNA、單堿基不匹配mRNA和100 pM APL mRNA在室溫下進(jìn)行充分雜交后的電流信號(hào)。圖1 A-2中顯示單堿基不匹配、PML-mRNA、RARα-mRNA及完全不匹配的信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于完全互補(bǔ)的信號(hào)強(qiáng)度明顯偏弱。

我們還通過(guò)莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針對(duì)mRNA電化學(xué)雜交，檢測(cè)了靶mRNA序列及其存在不同單堿基不匹配的3段序列的計(jì)時(shí)電流信號(hào)進(jìn)行了檢測(cè)與對(duì)比，如圖1 B。圖1 B-2顯示，當(dāng)靶序列中有單不匹配堿基存在時(shí)信號(hào)強(qiáng)度只能達(dá)到完全匹配靶序列的1/3左右，只有當(dāng)堿基為 G時(shí)即與探針完全互補(bǔ)時(shí)，信號(hào)增量才較大

通過(guò)以上對(duì)比，表明莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針具有較好的序列特異性，對(duì)不匹配堿基序列具有更好的識(shí)別作用。

2.2 HP探針對(duì)不同濃度靶mRNA的檢測(cè)

用計(jì)時(shí)電流法對(duì)靶mRNA進(jìn)行定量研究。室溫下，對(duì)不同濃度的靶序列進(jìn)行雜交檢測(cè)，考察該莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針DNA傳感芯片的靈敏度，結(jié)果如圖2。圖2A中靶mRNA濃度從i到a分別為0.5 pM、1 pM、10 pM、50 pM、250 pM、 500 pM、1 nM 、5 nM 和 10 nM。結(jié)果顯示電流值隨著濃度的增加而增加，并且濃度在0.5-300 pM范圍內(nèi)時(shí)，電流值（I）與mRNA濃度（c）具有較好的線性關(guān)系（圖2 B）, 線性回歸方程為I(nA)=364.6992+2.8741 cmRNA (pM)，r = 0.9955, 檢出限（S /N = 3）為 5.0×10-14 M

圖1 HP對(duì)靶mRNA的堿基多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

圖2 A不同濃度的雜交鏈電化學(xué)信號(hào)比較；B: 電流強(qiáng)度與目標(biāo)mRNA濃度的線性關(guān)系圖（0.5-300 pM）

2.3 重現(xiàn)性考察

為了考察實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，對(duì)1 nM的靶mRNA溶液平行測(cè)定5次，結(jié)果顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為10.3%。這說(shuō)明這種測(cè)試方法具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本文對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針修飾的多通道傳感芯片的性能進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，該傳感芯片具有良好的特異性，能較好地區(qū)分完全不匹配序列、RARα-mRNA、PML-mRNA、單堿基不匹配序列和靶序列，甚至能夠較好地識(shí)別同一位點(diǎn)不同不匹配堿基的序列。該探針與靶mRNA雜交后，電流值與靶序列濃度在0.5-300 pM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，對(duì)靶序列的檢出限也非常低為5.0×10-14 M，這表明該探針具有較好的靈敏性。進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，有望應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，可以滿足基因分析和臨床診斷的需要，具有很好前景。

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[2]Q Zhang，Y Wan，LH Wang,et al..The electrochemical DNA biosensor [J].Progress In Chemistry,2007, 19(10):1576-1584.