劉曉麗 馬禮鴻 王 凱 (遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563003)

腫瘤與原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的腫瘤細胞惡性增殖、免疫逃逸密切相關。Bmi-1和hTERT是與細胞增殖密切相關的基因〔1〕。本研究旨在探討B(tài)mi-1和hTERT在老年胃癌組織中的表達情況及其與病理分期的相關關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2005年1月至2012年5月我院老年胃癌患者100例作為觀察組，其中男67例，女33例，年齡43～61〔平均(52.38±6.38)〕歲;選擇在我院就診的胃良性腫瘤患者50例作為良性對照組，其中男34例，女16例，年齡39～60〔平均(52.39±6.32)〕歲;選擇在我院進行體檢的100名健康者作為健康對照組，其中男 65例、女 35例，年齡 40～60〔平均(50.98±6.29)〕歲。三組一般資料的差異不顯著(P＞0.05)。

1.2 熒光定量PCR檢測方法 取胃組織50 mg并用購買于Invitrogen公司的mRNA抽提及反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。熒光定量PCR采用Takara公司的試劑盒，擴增體系:cDNA 2 μl、mastermix 10 μl、上下游引物各 0.4 μl、去離子水 7.2 μl;擴增條件:95℃、15 s，特異性退火溫度72℃、30 s，40個循環(huán)。引物序列:β-actin:上游5'-TGTGTTGGCGTACAGGICTTTG-3'，下游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'，退火溫度58.1℃。Bmi-1:上 游 5'-GCCCGCTGCTGTCTAATG-3'，下 游 5'-TTTACACGT CT CGGATCTTG-3'，退火溫度 60.8℃;hTERT:上游:5'-AAGATGGTTACCTGCGACTG-3'， 下 游:5'-CCGGGTCTGGAACGATGACC-3'，退火溫度62.1℃。分別擴增同一樣本的目的基因和內參基因，通過ΔΔCt法求出觀察組、良性對照組相對于健康對照組的mRNA含量。

1.3 免疫印跡檢測方法 取胃組織50 mg加入蛋白裂解液300 μl后勻漿，離心后取上清 15.6 μl，加入上樣緩沖液 4 μl、DTT 2.4 μl配成上樣液。按配方配置10%的下層膠和5%的上層膠進行垂直電泳，100 V、20 min，120 V、90 min。垂直電泳結束后取出凝膠進行電轉膜，封閉后加入羊來源的Bmi-1和hTERT第一抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3遍，加HRP標記的驢抗羊二抗孵育1 h，而后進行顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析和單因素回歸分析。

2 結果

2.1 各組胃組織中Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量觀察組胃組織Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量均明顯高于良性對照組和健康對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量 在不同TNM分期的觀察組患者中，Bmi-1、hTERT的mRNA含量TNMⅠ＜TNMⅡ＜TNMⅢ＜TNMⅣ(P＜0.05)。見表2。

2.3 胃癌患者TNM分期與Bmi-1和hTERT含量的相關性胃癌患者的Bmi-1、hTERT的蛋白含量與TNM分期呈正相關(r=0.572、0.492，P ＜0.05)。見表3。

表1 各組Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

表1 各組Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

組別 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT觀察組 100 235.94±24.77 245.48±25.21 251.52±27.12267.41±29.42良性對照組 50 105.32±11.23 103.16±14.32 103.63±11.90 103.82±15.12健康對照組100 100 100 100 100 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

TNM分期 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT 蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT TNMⅠ 23 123.56±11.42 135.26±13.98 115.56±12.22 129.43±13.23 TNMⅡ 28 165.13±14.53 175.96±18.21 145.13±15.41 169.55±17.52 TNMⅢ 30 245.94±25.88 268.55±29.52 235.94±26.13 262.95±28.32 TNMⅣ 19 358.25±39.6 396.05±40.17 328.52±34.6 346.42±35.23 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表3 胃癌患者病理分期與Bmi-1和hTERT含量的相關性

3 討論

近年來，越來越多的臨床試驗和基礎研究均極為關注胃癌發(fā)生的分子機制，旨在通過研究其分子機制來發(fā)現(xiàn)早期診斷胃癌的標志物〔3〕。目前認為，胃癌的發(fā)生與原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的腫瘤細胞惡性增殖、免疫逃逸密切相關。其中，Bmi-1是一類原癌基因，在乳腺癌、直腸癌、肺癌等腫瘤中均有高表達〔3〕。相關研究顯示，Bmi-1所編碼的蛋白能夠對p16、p19等抑癌基因發(fā)揮負性調節(jié)作用。在體內，p16、p19基因主要編碼與細胞周期相關的蛋白，能夠參與細胞增殖、分化、凋亡、衰老的調控〔4，5〕。hTERT是編碼端粒酶逆轉錄酶的基因，僅在干細胞和腫瘤細胞中表達，參與端粒的復制〔6〕。當機體在環(huán)境因素、遺傳因素等作用下發(fā)生Bmi-1、hTERT基因過度表達時，一方面會抑制p16、p19基因編碼細胞周期蛋白，另一方面會造成端粒酶mRNA不斷復制、不會隨細胞增殖而縮短〔7〕。兩者共同作用會造成細胞的增殖、DNA的復制不受抑制，發(fā)生惡性增殖，最終導致癌癥的發(fā)生〔8〕。Bmi-1、hTERT基因的表達異常與胃癌的發(fā)生密切相關〔9〕。

本研究結果提示Bmi-1、hTERT基因的蛋白水平與腫瘤分期呈正相關，即腫瘤分期越高、Bmi-1和hTERT基因表達越多。

1 張愛榮，梁麗梅，許 穎，等.Bmi-1蛋白在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者術后生存的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(18):3612-3.

2 Takubo K，Aida J，Sawabe M.The normal anatomy around the oesophagogastric junction:a histopathologic view and its correlation with endoscopy〔J〕.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2008;22(4):569-83.

3 馮 艷，宋立兵，郭寶紅.Bm i-1在乳腺癌組織中的表達及意義〔J〕.癌癥，2007;26(2):154-7.

4 Glinsky GV，Berezovska O，Glinskii AB.Microarray analysis identifies a death from cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer〔J〕.J Clin Invest，2005;115(6):1503-21.

5 孫振華，卜 平.胃癌PRL-3與Bmi-1 mRNA聯(lián)合表達的定量分析及其意義〔J〕.廣東醫(yī)學，2012;33(7):987-9.

6 李力銘，錢葉本.hTERT在原發(fā)性肝癌中的表達及其臨床意義〔J〕.肝膽外科雜志，2010;20(3):218-1.

7 王 平，龐全海，夏 玉.基因與干細胞增殖和腫瘤發(fā)生研究進展〔J〕.動物醫(yī)學進展，2012;33(6):122-5.

8 尹天泉，張 米，劉海蓮，等.胃癌分化程度與神經分布相關性及癌細胞與神經細胞相互作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(12):1505-9.

9 Silva J，Garcia JM，Pena C.Implication of polycomb members Bmi-1，Mel-18，and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a，p14ARF，h-TERT，and C-Myc expression in primary breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(23):6929-36.