信燕華 馬麗娟 翟堃等

[摘要] 目的 探討寧夏回漢族人群中Wnt3基因rs142167和rs7216231位點單核苷酸多態(tài)性（SNP）與非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）的相關(guān)性。方法 收集寧夏地區(qū)回漢族人群非綜合征型唇腭裂患者371例為病例組，其中漢族患者

166例，回族患者205例；收集患者父親196例，患者母親224例，其中150例患者為NSCL/P核心家系；258例健康新生兒為對照組，其中漢族190例，回族68例。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測Wnt3基因多態(tài)位點rs142167和rs7216231基因型，對比分析2組的基因型和等位基因，并進行傳遞不平衡檢驗（TDT）和以家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性檢驗（FBAT）分析。結(jié)果 回漢族人群病例組與對照組比較及其民族分層比較，唇裂、腭裂、唇腭裂及總病例組rs142167和rs7216231位點均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。TDT分析結(jié)果顯示：rs142167和rs7216231位點的等位基因均不存在過傳遞（P>0.05）。FBAT分析結(jié)果顯示：單倍型G-G具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 Wnt3基因多態(tài)性與寧夏地區(qū)回漢族人群非綜合征型唇腭裂不存在相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 非綜合征型唇腭裂； Wnt3； 單核苷酸多態(tài)性

[中圖分類號] R 782.2 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.017

非綜合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with

or without cleft palate，NSCL/P）的病因較為復(fù)雜，

涉及環(huán)境與遺傳因素及其交互作用[1]。目前已有多

個可能相關(guān)的候選基因及環(huán)境因素，但不同地區(qū)甚至不同表型NSCL/P的候選基因有很大差異，研究結(jié)果重復(fù)性差[2-3]。Wnt家族參與生物體內(nèi)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，影響著生物體的生長發(fā)育。2008年Chiquet等[4]報道了Wnt家族的Wnt3基因多態(tài)性與NSCL/P有相關(guān)性。2010年Menezes等[5]也發(fā)現(xiàn)Wnt3基因多態(tài)性與

NSCL/P有顯著相關(guān)性。目前，Wnt3基因多態(tài)性與NSCL/P的相關(guān)性尚未得到廣泛的支持及驗證，國內(nèi)也無關(guān)于Wnt3基因與NSCL/P相關(guān)性的研究報道。本研究選擇人口流動性不大、遺傳較為穩(wěn)定的寧夏地區(qū)人群為研究對象，以揭示中國寧夏地區(qū)回漢族人群中Wnt3基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide po-

lymorphism，SNP）與NSCL/P是否存在相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集寧夏地區(qū)回漢族人群的SNP患者371例為病例組，其中漢族患者166例，回族患者205例，要求患者家庭至少三代為寧夏籍貫，并且排除其他先天性畸形及綜合征型唇腭裂。收集患者父親196例，患者母親224例，其中150例患者為NSCL/P核心家系。

收集同期在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院出生的258例健康新生兒為對照組，其中漢族190例，回族68例，要求家庭至少三代為寧夏籍貫。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polyme-

rase chain reaction-restriction fragment length

polymorphisms，PCR-RFLP）檢測

采集外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，提取基因組DNA，進行PCR擴增。應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物和內(nèi)切酶（表1）。PCR反應(yīng)體系：待測DNA模板50～100 μg、MasterMix 12.5 μL。上下游引物各2 μmol·L-1，用去離子水補足為25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，rs142167 60 ℃及rs7216231 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物酶切：取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，加Cf rⅠ限制性內(nèi)切酶和NmuC Ⅰ1 U及相應(yīng)的10×buffer 1 μL，37 ℃水浴酶切12～16 h。電泳分析酶切產(chǎn)物，取10 μL酶切產(chǎn)物上樣，在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，確定個體的基因型。隨機挑選10%的標(biāo)本進行直接測序。

1.3 統(tǒng)計分析

對患者及其父母和對照組的基因型分布進行Hardy-Weinberg（HW）平衡檢驗。采用PASW statis-tics 18軟件對患者與對照組的基因型和等位基因進行分析，采用傳遞不平衡檢驗（transmission disequi-

librium test，TDT）以及以家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性檢驗

（family based association test，F(xiàn)BAT）分析Wnt3的

rs142167和rs7216231多態(tài)位點與NSCL/P的相關(guān)性，并進行2個位點間組合的單倍型分析。FBAT參數(shù)設(shè)定為基因型模型、雙等位遺傳模型。依據(jù)民族不同，將病例組與對照組人群又分為漢族和回族，進行rs142167、rs7216231基因型及等位基因的比較。

2 結(jié)果

2.1 基因分型

rs142167和rs7216231多態(tài)位點的酶切電泳分型結(jié)果見圖1、2。酶切后分型的結(jié)果與測序的結(jié)果完全一致。

M：DNA marker；1、3、7：雜合子AG；2、4、5：純合子GG；6：純合子：AA。

2.2 HW平衡檢驗

HW平衡檢驗表明：患者及其父母和對照組的基因頻率分布均符合HW平衡，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

2.3 2組的基因型和等位基因分析

rs142167位點和rs7216231位點基因型、等位基因頻率在患者組及對照組的分布和比較見表2～4。與對照組相比較，唇裂、腭裂、唇腭裂以及總病例組的rs142167（P=0.33，P=0.51，P=0.61，P=0.50）和

rs7216231（P=0.35，P=0.15，P=0.29，P=0.25）位點均無統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組漢族人比較，唇裂組、腭裂組、唇腭裂組及總病例組漢族人的rs142167（P=0.98，P=0.31，P=0.69，P=0.72）和rs7216231（P=1.10，P=0.24，P=0.62，P=0.75）位點均無統(tǒng)計學(xué)差異。

與對照組回族人比較，唇裂組、腭裂組、唇腭裂組及總病例組回族人的rs142167（P=0.25，P=0.99，P=0.76，P=0.89）和rs7216231（P=0.19，P=0.56，P=

0.63，P=0.45）位點均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 TDT分析

TDT分析結(jié)果（表5）顯示：rs142167和rs7216231位點的等位基因均不存在過傳遞（P>0.05）。

2.5 FBAT分析

FBAT分析結(jié)果（表6）表明：單倍型G-G具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），是NSCL/P的保護性單倍型，其他3種單倍型均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

NSCL/P是一類多基因遺傳病，病因較復(fù)雜，具有顯著的遺傳異質(zhì)性，并且受環(huán)境因素影響。Wnt家族基因散在分布于各條染色體中，在進化中高度保守，編碼一類富含半胱氨酸的分泌蛋白，在胚胎的原腸胚及中胚葉的形成過程中起重要的作用，調(diào)節(jié)腫瘤細胞和干細胞的增殖、分化和存活[6]，并涉

及組織器官生長發(fā)育的多個方面。Niemann等[7]在對tetra-amelic綜合征的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt3基因的純合無義突變可使患者的四肢闕如、泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙并伴有唇裂。Chiquet等[4]2008年報道在人類唇

腭裂病例中發(fā)現(xiàn)了Wnt基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)的多個突變與之相關(guān)，并報道了Wnt3在內(nèi)的7個Wnt基因的38個單核苷酸多態(tài)性位點和NSCL/P相關(guān)性的研究。其研究結(jié)果顯示：Wnt3與美國人群和西班牙人群NSCL/P具有顯著相關(guān)性。Menezes等[5]在高加索人群中也發(fā)現(xiàn)Wnt3與NSCL/P有顯著相關(guān)性。本文探討了Wnt3的SNP多態(tài)位點與中國寧夏回漢族人群NSCL/P之間的相關(guān)性。

本研究病例組Wnt3的rs142167位點的A等位基因頻率為34%，G等位基因頻率為66%，與HapMap數(shù)據(jù)庫中北京漢族人群A等位基因頻率36%和G等位基因頻率64%基本一致。Menezes等[5]報道rs142167

與非綜合征型唇腭裂具有顯著相關(guān)性。而本研究中rs142167在各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），提示

SNP rs142167與寧夏地區(qū)回漢族人群NSCL/P不相關(guān)。rs7216231位點的A等位基因頻率為65%，G等位基因頻率為35%，與HapMap數(shù)據(jù)庫中北京漢族人群A等位基因頻率64.8%和G等位基因頻率35.2%也基本一致。同時本研究結(jié)果也提示rs7216231與寧夏地區(qū)回漢族人群NSCL/P不相關(guān)。這與其他學(xué)者[4-5]的研究結(jié)果不一致，這種差異的產(chǎn)生可能與遺傳異質(zhì)性及種族差異性有關(guān)。單倍型G-G（rs142167-rs7216231位

點組成的單倍型）具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），G-G是NSCL/P的保護性單倍型（Z=-2.180），這一結(jié)果可能是

由于單個等位基因不是造成NSCL/P的因素或保護因素，但當(dāng)兩個等位基因疊加或者多個等位基因疊加就會增加NSCL/P的患病概率或者保護概率。

NSCL/P被公認(rèn)為是一種由多個微效基因與環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病，具有明顯的遺傳異質(zhì)性、表型復(fù)雜性及種族差異性。本實驗結(jié)果在一定程度上反映了NSCL/P存在種族差異性及遺傳異質(zhì)性，但不能排除環(huán)境因素的影響，今后尚需進一步增加對Wnt3的其他SNP位點的研究，并納入環(huán)境因素一起來探討其對NSCL/P發(fā)病的影響。

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（本文編輯 李彩）