唐成芳 竇祈 劉瑞瑞等

[摘要] 目的 研究局部應(yīng)用酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣（CPP-ACP）對(duì)牙本質(zhì)粘接界面耐pH循環(huán)老化的影響。

方法 常規(guī)制備牙本質(zhì)粘接試件，將其隨機(jī)分為3組，其中2組行pH循環(huán)，期間每日分別加用CPP-ACP、去離子蒸餾水（DDW）處理，15 d后測(cè)定微拉伸粘接強(qiáng)度，觀察斷裂模式、界面形貌及納米滲漏，并確定混合層內(nèi)元素含量。另一組試件制備完成后即刻測(cè)試。結(jié)果 無(wú)pH循環(huán)組及pH循環(huán)/CPP-ACP組微拉伸粘接強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二者均顯著高于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05）。試件均以混合破壞為主。pH循環(huán)/CPP-ACP組混合層質(zhì)量?jī)?yōu)于pH循環(huán)/DDW組，納米滲漏少。無(wú)pH循環(huán)組及pH循環(huán)/CPP-ACP組混合層內(nèi)Ca含量顯著高于pH循環(huán)/DDW組，Ag含量顯著低于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05）。結(jié)論 牙本質(zhì)粘接界面局部應(yīng)用CPP-ACP可增強(qiáng)界面耐pH循環(huán)老化的能力，延緩

界面退變。

[關(guān)鍵詞] 酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣； 樹脂-牙本質(zhì)粘接； 再礦化； 粘接強(qiáng)度； 納米滲漏

[中圖分類號(hào)] R 783.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.002

口腔粘接技術(shù)奠定了口腔微創(chuàng)修復(fù)、美容修復(fù)的基礎(chǔ)，已被廣泛應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)的各個(gè)分支領(lǐng)域，在現(xiàn)代牙科治療中發(fā)揮不可替代的作用。盡管隨著粘接技術(shù)的不斷進(jìn)步和粘接材料的更新?lián)Q代，即刻粘接效果得到顯著改善，然而由于牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性和口腔環(huán)境的復(fù)雜，牙本質(zhì)粘接耐久性仍不盡人意。酸蝕劑脫礦程度和粘接樹脂滲透能力不匹配以及親水樹脂單體比例過(guò)高等因素引起樹脂向脫礦牙本質(zhì)膠原網(wǎng)滲透不足，使混合層底部存在未完全被樹脂包裹的裸露膠原，成為界面的薄弱區(qū)域[1]，易受到水、酶、細(xì)菌等因素影響而發(fā)生降解，破壞界面的完整和穩(wěn)定，導(dǎo)致最終粘接失敗[2-4]。在提高粘接耐久性的不斷探索中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了乙醇濕粘接技術(shù)[5]、抗菌粘接材料[6]、酶抑制劑[7]等眾多措施，盡管能在一定程度上延緩粘接界面的老化，但由于裸露膠原未被封閉，因而膠原降解、粘接失敗的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。有學(xué)者[8-9]指出：如果能提供合適的再礦化條件，混合層底部的裸露膠原可以發(fā)生再礦化，以改善混合層質(zhì)量，有助于提高粘接耐久性。

酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣（casein phospho-

peptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）是一種經(jīng)典的再礦化活性物質(zhì)[10-11]。大量研究[12-15]證實(shí)：局部應(yīng)用CPP-ACP可抑制牙本質(zhì)脫礦，并促進(jìn)人工齲損處的再礦化。然而粘接后在界面區(qū)局部應(yīng)用CPP-ACP是否對(duì)混合層局部裸露膠原亦有保護(hù)作用，促進(jìn)其再礦化，增強(qiáng)界面薄弱區(qū)域而提高粘接耐久性，目前尚不明確。

本研究應(yīng)用pH循環(huán)模擬日常進(jìn)食過(guò)程中口內(nèi)酸堿度的變化，旨在探討粘接后局部應(yīng)用CPP-ACP能否提高樹脂-牙本質(zhì)粘接界面耐pH循環(huán)老化的能力。 1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和器械

不含氟的護(hù)牙素（含10%CPP-ACP，GC公司，

日本），37%的磷酸凝膠（Vericom公司，韓國(guó)），牙

本質(zhì)粘接劑（AdperTM Single Bond2，3M公司，美國(guó)），復(fù)合樹脂（Filtekz250，3M公司，美國(guó)），硝酸銀（上海科豐化學(xué)試劑有限公司）。

2.5%CPP-ACP溶液：護(hù)牙素與去離子蒸餾水（distilled and deionized water，DDW）以1∶3的比例振蕩混勻備用；中性緩沖液[16]：用DDW溶解配制，含20 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸、2.25 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、130 mmol·L-1 KCl、1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH為7.0；酸性緩沖液[16]：50 mmol·L-1 CH3COOH、

2.25 mmol·L-1 CaCl2、130 mmol·L-1 KCl、1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH為5.0。

萬(wàn)能測(cè)試機(jī)（EZ test，Shimadzu公司，日本），體視顯微鏡（MLC-150，Motic公司，美國(guó)），場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（field emission scanning electron microscopy，F(xiàn)E-SEM）、X線能譜儀（Hitachi公司，日本）。

1.2 樣本制備

收集12顆新近拔除的無(wú)齲壞、完整的第三磨牙，浸泡于含有0.002%疊氮鈉的4 ℃生理鹽水中備用。采用慢速切割機(jī)在流水降溫條件下垂直于牙長(zhǎng)軸去除冠方釉質(zhì)，暴露牙本質(zhì)。牙本質(zhì)表面采用600目碳化硅砂紙?jiān)诹魉麓蚰?0 s，超聲清洗30 s后，氣槍吹干，用37%的磷酸凝膠酸蝕15 s，流水沖洗30 s，濕棉球輕輕蘸干表面多余的水分，按說(shuō)明書的使用方法涂布Single Bond2粘接劑并用棉棒攪動(dòng)15 s，氣槍輕吹10 s，按同樣方法再涂布一層輕吹，光照固化10 s，分層堆塑Filtekz250復(fù)合樹脂至4 mm厚度。在室溫下水存24 h后，其中6顆牙制備8 mm×4 mm×2 mm的牙本質(zhì)片狀粘接試件18片，6顆牙制備8 mm×0.7 mm×0.7 mm的微拉伸條狀試樣135條，使粘接界面位于試件的中央。牙本質(zhì)粘接片狀試件表面距粘接界面1 mm以外區(qū)域均勻涂布兩層抗酸指甲油備用。

1.3 分組表面處理及pH循環(huán)

每顆牙的微拉伸試件及片狀試件分別隨機(jī)分為無(wú)pH循環(huán)組、pH循環(huán)/DDW組和pH循環(huán)/CPP-ACP組。將后2組試件置于37 ℃恒溫水浴中按照如下步驟進(jìn)行pH循環(huán)處理：酸性緩沖液中浸泡30 min，DDW或2.5%CPP-ACP溶液中分別浸泡5 min，最后放入中性緩沖液中浸泡處理10 min。每步處理之間均采用去離子水沖洗1 min，1 d循環(huán)3次，其余時(shí)間試件置于中性緩沖液中，共循環(huán)處理15 d，每天換液1次。

1.4 微拉伸強(qiáng)度測(cè)試及斷裂模式分析

pH循環(huán)15 d后，分別從pH循環(huán)/DDW組、pH循環(huán)/CPP-ACP組選43條微拉伸試件，將試件用502膠固定在專用夾具上，并于萬(wàn)能測(cè)試機(jī)上以0.5 mm·min-1的加載速度測(cè)試?yán)鞌嗔褧r(shí)的最大載荷值（N），并計(jì)算單位面積斷裂強(qiáng)度（MPa），即微拉伸強(qiáng)度[4]。無(wú)pH循環(huán)組試件制備完成后即刻測(cè)定微拉伸強(qiáng)度。

收集粘接強(qiáng)度測(cè)試后斷裂試件的牙本質(zhì)斷端，體視顯微鏡下觀察斷裂模式。按照斷裂部位，分為4種類型[17]，具體如下。1）界面破壞：斷裂發(fā)生于粘接劑和牙本質(zhì)界面或粘接劑與復(fù)合樹脂界面，也包括粘接劑內(nèi)聚破壞；2）混合破壞：牙本質(zhì)或樹脂內(nèi)聚破壞與界面破壞在斷裂面中并存；3）樹脂內(nèi)聚破壞：斷裂發(fā)生在復(fù)合樹脂內(nèi)；4）牙本質(zhì)內(nèi)聚破壞：斷裂發(fā)生于牙本質(zhì)內(nèi)。然后從中選取2～3個(gè)粘接強(qiáng)度接近于平均值的試樣，自然干燥，噴金，F(xiàn)E-SEM下觀察牙本質(zhì)斷端顯微形貌。

1.5 粘接界面表面顯微形貌觀察

pH循環(huán)15 d后，分別從pH循環(huán)/DDW組、pH循環(huán)/CPP-ACP組隨機(jī)選取微拉伸試件各2條，流水沖洗，自然干燥，噴金，F(xiàn)E-SEM觀察粘接界面顯微形貌。無(wú)pH循環(huán)組試件制備完成后即刻觀察。

1.6 粘接界面X線能量色譜分析（energy-dispersive

X-ray spectrometry，EDS）及納米滲漏觀察

片狀粘接試件避光浸泡于50%氨化硝酸銀溶液24 h后，蒸餾水沖洗5 min，置于顯影液中熒光照射顯影8 h，使Ag+充分還原，流水沖洗5 min[18]。依次用1 200、1 500、2 000目的碳化硅砂紙流水下打磨試件至1 mm厚度，超聲清洗30 s，自然干燥，噴金，F(xiàn)E-SEM背散射電子模式下觀察粘接界面納米滲漏，采用X線能譜儀線掃描模式分析粘接界面Si、P、Ag、Ca元素的分布情況，定性觀察界面內(nèi)部的再礦化效果。結(jié)合EDS線掃描結(jié)果，確定每個(gè)試件混合層的確切范圍，并在矩形選區(qū)內(nèi)分析Ca、P、Ag、Si以及Pt的原子百分比含量[19]，以定量評(píng)價(jià)混合層內(nèi)的相

對(duì)礦化情況和微滲漏程度，每個(gè)試件選5個(gè)視野，求平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)微拉伸粘接強(qiáng)度及混合層Ag、Ca原子百分比含量進(jìn)行單因素方差分析，組間采用LSD兩兩比較；對(duì)各組斷裂模式采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 微拉伸粘接強(qiáng)度及斷裂模式

各組微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)量結(jié)果見表1。pH循環(huán)

15 d后，可見pH循環(huán)/CPP-ACP組與無(wú)pH循環(huán)組微拉伸強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者均顯著高于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05）。斷裂模式的分析結(jié)果見表1和圖1。

各組斷裂模式均以混合破壞為主，但pH循環(huán)/DDW組界面破壞較無(wú)pH循環(huán)組呈增高趨勢(shì)，且混合層底部破壞較多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而pH循環(huán)/CPP-ACP組界面破壞顯著低于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05），且混合層頂部破壞較多，樹脂內(nèi)聚破壞明顯增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 粘接界面微觀形貌

無(wú)pH循環(huán)組試件表面可見玷污層，粘接界面顯微結(jié)構(gòu)不甚清晰，但未見明顯微裂隙；pH循環(huán)/DDW組粘接界面存在明顯的微裂隙，混合層較疏松，牙本質(zhì)端小管清晰，牙本質(zhì)表面可見大小不等的疏松顆粒；pH循環(huán)/CPP-ACP組粘接界面無(wú)明顯裂隙，混合層相對(duì)致密，牙本質(zhì)表面有大量致密的顆粒沉積（圖2）。

2.3 粘接界面內(nèi)EDS分析及納米滲漏觀察

粘接界面內(nèi)背散射觀察結(jié)合EDS線掃描結(jié)果見圖3。由圖3可見，圖中白線表示進(jìn)行線掃的部位，紅色代表硅元素，綠色代表磷元素，深藍(lán)色代表銀元素，天藍(lán)代表鈣元素，各種顏色的線條出現(xiàn)峰值的部位代表了該部位含有很高濃度的相應(yīng)元素。各組銀染均主要集中在混合層內(nèi)，但程度有所不同。無(wú)pH循環(huán)組銀染最少，基本位于混合層基底部，滲漏不明顯。pH循環(huán)/DDW組混合層內(nèi)銀染程度明顯增加，部分區(qū)域銀染布滿全層；pH循環(huán)/CPP-ACP組銀染程度略高于無(wú)pH循環(huán)組，但明顯輕于pH循環(huán)/DDW組，銀顆粒主要位于混合層基底部，大部分區(qū)域銀染不明顯。

無(wú)pH循環(huán)組、pH循環(huán)/DDW組鈣、磷含量自牙本質(zhì)頂向混合層頂部呈逐漸降低的趨勢(shì)，到粘接劑層和樹脂層基本恒定，且pH循環(huán)/DDW組鈣下降更加明顯。pH循環(huán)/CPP-ACP組自混合層基底向頂部鈣、磷含量明顯高于粘接劑層，但低于牙本質(zhì)，分布基本均勻?；旌蠈舆x區(qū)掃描結(jié)果見表2。由表2可見，pH循環(huán)/CPP-ACP組Ca、Ag原子百分比含量與無(wú)pH循環(huán)組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；無(wú)pH循環(huán)組和pH循環(huán)/CPP-ACP組Ca原子百分比含量均顯著高于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05），而Ag原子百分比含量顯著低于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05）。

3 討論

粘接修復(fù)體在口腔中受到細(xì)菌產(chǎn)酸、酶以及水環(huán)境等各種因素影響可破壞粘接界面的穩(wěn)定性[2-4]。

pH循環(huán)可模擬日?？谇画h(huán)境中酸堿度和礦物質(zhì)飽和度的動(dòng)態(tài)變化，比水存老化更接近口腔實(shí)際環(huán)境，被廣泛用于齲病防治、粘接耐久性及再礦化研究[16，20-21]。

因此本研究采用pH循環(huán)老化方式測(cè)試粘接完成后局部應(yīng)用CPP-ACP能否延緩粘接界面老化的發(fā)生。

用于粘接界面掃描電鏡觀察的試件常規(guī)會(huì)進(jìn)行短暫的酸處理或表面鏡面拋光，以去除切割試件時(shí)形成的玷污層對(duì)顯微形貌的遮蓋。而本實(shí)驗(yàn)中pH循環(huán)組試件經(jīng)pH循環(huán)中的酸處理已經(jīng)去除了玷污層，就沒(méi)有另行酸處理，而無(wú)pH循環(huán)的試件作為陰性對(duì)照，采用了與經(jīng)pH循環(huán)試件相同的掃描電鏡觀察前的樣本處理步驟，因而玷污層未被去除，導(dǎo)致該組FE-SEM觀察時(shí)粘接界面顯微形貌結(jié)構(gòu)不清晰。

pH循環(huán)15 d后，pH循環(huán)/DDW組粘接界面表面出現(xiàn)明顯微裂隙，混合層疏松，而pH循環(huán)/CPP-ACP組試件混合層較致密。無(wú)pH循環(huán)組及pH循環(huán)/CPP-ACP組微拉伸強(qiáng)度顯著高于pH循環(huán)/DDW組（P<0.05）。

結(jié)果表明，pH循環(huán)后粘接界面發(fā)生了明顯老化，這與Peris等[21]的研究結(jié)果一致，即pH循環(huán)后粘接強(qiáng)度會(huì)發(fā)生顯著下降。這可能是酸性緩沖液激活了內(nèi)源性的金屬基質(zhì)蛋白酶，加劇了混合層底部裸露膠原纖維的降解及樹脂酯鍵的水解，加速了界面穩(wěn)定性破壞的緣故[2-3，21]。此外，酸性緩沖液pH為5.0的弱

酸，可能使粘接界面內(nèi)鈣離子進(jìn)一步流失，進(jìn)而可能形成繼發(fā)齲[21]，減弱牙本質(zhì)端強(qiáng)度。本研究中斷

裂模式分析進(jìn)一步印證了上述結(jié)果。pH循環(huán)/DDW組界面破壞及牙本質(zhì)內(nèi)聚破壞比例較無(wú)pH循環(huán)組略增高，且混合層底部破壞較多，這可能是由于pH循環(huán)過(guò)程中的酸處理導(dǎo)致牙本質(zhì)端脫礦從而削弱了牙本質(zhì)及混合層。而pH循環(huán)/CPP-ACP組界面破壞顯著減少，且混合層頂部破壞較多，樹脂內(nèi)聚破壞呈增加趨勢(shì)，可能與CPP-ACP的應(yīng)用減弱了酸對(duì)牙本質(zhì)的作用，并使牙本質(zhì)發(fā)生了再礦化，相對(duì)加強(qiáng)了界面及牙本質(zhì)端的原因有關(guān)。粘接界面EDS及納米滲漏觀察也提示pH循環(huán)加劇了界面老化，加重了納米滲漏的程度，CPP-ACP能改善樹脂-牙本質(zhì)粘接界面的耐pH循環(huán)老化性能，相對(duì)減輕納米滲漏，延緩界面老化。

CPP-ACP延緩粘接界面混合層老化的作用可能與以下機(jī)制有關(guān)：1）CPP-ACP穩(wěn)定鈣磷，有助于混合層的礦物沉積。CPP-ACP是富含磷酸絲氨酸的生物活性肽與無(wú)定形磷酸鈣結(jié)合形成納米尺度的復(fù)合體，其能將非晶態(tài)的磷酸鈣固定于牙齒表面，并維持混合層再礦化需要的過(guò)飽和的鈣磷離子濃度，形成再礦化所需的離子滲透梯度，從而促進(jìn)混合層及脫礦牙本質(zhì)的再礦化[10-12，22-23]。2）CPP-ACP已被證實(shí)具有抑制牙本質(zhì)脫礦的作用，其機(jī)制可能與CPP-ACP釋放堿性氨基酸并接受氫離子，阻礙其擴(kuò)散或者釋放鈣離子相關(guān)[15，23]。本實(shí)驗(yàn)中CPP-ACP究竟是促進(jìn)再礦化還是抑制脫礦起決定作用尚待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)了CPP-ACP局部應(yīng)用可提高粘接界面耐pH循環(huán)老化能力，促進(jìn)混合層礦物沉積，提高粘接界面耐久性，但受試粘接劑類型局限，且觀察時(shí)間較短，其長(zhǎng)期效果還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（本文采編 陳謙明）