蘇芳菊，張衛(wèi)澤，馬凌，王菲，趙小華，敖雪玲，劉燕

·基礎研究·

缺氧誘導因子1α在異丙腎上腺素誘導的大鼠心房纖維化中的表達及意義

蘇芳菊，張衛(wèi)澤，馬凌，王菲，趙小華，敖雪玲，劉燕

目的探討缺氧誘導因子1α(HIF-1α)在鹽酸異丙腎上腺素(ISO)誘導的大鼠心房纖維化中的表達及其可能機制。方法健康雄性Wistar大鼠30只，隨機均分為空白對照組、ISO組、ISO+西羅莫司(Rapa)干預組(Rapa組)。于實驗15d時處死大鼠取心肌組織，放射免疫法檢測血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的含量，HE和Masson染色法觀察纖維化程度即膠原容積分數(shù)(CVF)，免疫組織化學法、Western blotting檢測HIF-1α、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在大鼠心房纖維化組織中的表達，并分析HIF-1α、TGF-β1、MMP-9蛋白表達量與心房纖維化指標CVF的相關性，以及HIF-1α、TGF-β1、MMP-9蛋白表達量之間的相關性。結(jié)果ISO組、Rapa組AngⅡ含量較空白對照組明顯升高(P＜0.01)?？瞻讓φ战MCVF為15.482%±0.837%，無心房纖維化，而Rapa組、ISO組CVF分別為16.730%±1.052%、86.704%±1.928%，Rapa組較ISO組的心房纖維化程度明顯減弱(P＜0.01)。免疫組化及Western blotting檢測顯示，與空白對照組相比，ISO組HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表達量均明顯增加(P＜0.01)，與ISO組比較，Rapa組中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表達量明顯降低(P＜0.01)。HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表達量均與心房纖維化程度(以CVF為評價指標)呈正相關(r=0.987，r=0.988，r=0.917，P＜0.01)；HIF-1α與TGF-β1、MMP-9蛋白表達量呈正相關(r=0.976，r=0.901，P＜0.01)，MMP-9與TGF-β1蛋白表達量亦呈正相關(r=0.912，P＜0.01)。結(jié)論在異丙腎上腺素誘導的大鼠心房纖維化過程中，AngⅡ、HIF-1α、TGF-β1、MMP-9發(fā)揮著重要作用。

缺氧誘導因子1，α亞基；心房；纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子β1；基質(zhì)金屬蛋白酶9

心房顫動(atrial fibrillation，AF)在臨床上有較高的致殘率和致死率[1]，也是常見的心律失常之一。近年來血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)與AF發(fā)生及維持的關系已備受關注。發(fā)生AF時AngⅡ含量增加并可最終誘導心房纖維化[2]，而心房間質(zhì)纖維化具有誘發(fā)和維持AF的雙重作用[3]。研究指出，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)1α的升高與AngⅡ有關[4]，并參與腎纖維化[5]，但其在心肌纖維化中的作用未見報道。本研究參照Zhang等[6]的方法，采用皮下大劑量注射鹽酸異丙基腎上腺素(isoproterenol，Iso)致AngⅡ升高建立大鼠心房纖維化模型，同時給予HIF-1α抑制劑(雷帕霉素)[7]干預，對心肌組織中AngⅡ、HIF-1α、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopmteinases 9，MMP-9)蛋白表達水平以及心房纖維化程度進行檢測并分析其相關性，以初步探討HIF-1α在Iso誘發(fā)心房纖維化過程中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及模型建立 健康雄性Wistar 大鼠30只，體重180±20g，購自蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物中心，隨機分為空白對照組、Iso組、Iso+西羅莫司(sirolimus，又名雷帕霉素，rapamycin，Rapa)干預組(Rapa組)，每組10只。Iso組、Rapa組均按5mg/ (kg·d)，1次/d，連續(xù)7d腹部多點皮下注射Iso(上海和豐制藥有限公司，批號080705)，Rapa組于注射Iso的第2天同時按3ml/(kg·d)連續(xù)給予西羅莫司口服液(杭州中美華東制藥有限公司，規(guī)格50ml/50mg，批號110901)灌胃14d。上述給藥的同時，空白對照組、Iso組分別用與Rapa組等量的雙蒸水進行灌胃。全組大鼠15d后行頸椎脫臼處死。

1.2方法

1.2.1標本采集及保存 大鼠處死后取心臟，沿心臟冠狀面最大橫徑處切除部分心肌組織置于10%甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，連續(xù)切片5張，其中2張用于HE和Masson染色，剩余3張用免疫組化法分別檢測HIF-1α、TGF-β1和MMP-9的表達。剩余心臟組織置凍存管于液氮中保存，取部分采用放射免疫法檢測Ang Ⅱ含量，部分采用Western blotting檢測HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白的表達。

1.2.2大鼠心肌組織中Ang Ⅱ含量測定 參考AngⅡ放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)說明書，采用放射免疫法測其濃度。

1.2.3心肌纖維化觀察 行常規(guī)HE和Masson染色。心房纖維化指標膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)計算公式為：CVF=膠原面積/全視野面積×100%。每張Masson染色切片選取3個無血管視野(×400)，采用Image-Pro Plus6.0圖像掃描軟件進行圖像分析，計算心肌CVF。

1.2.4免疫組織化學法檢測 取心肌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、抗原熱修復、封閉液封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、復染、透明、封固等步驟，以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性結(jié)果以試劑公司提供的陽性片為依據(jù)。兔抗大鼠HIF-1α、MMP-9、TGF-β1多克隆抗體及鼠抗GAPDH單克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司，一抗工作液濃度均為1:50，二抗山羊抗兔由Jackson公司提供，工作濃度為1:500。

1.2.5Western blotting檢測 將心肌組織塊置于液氮預冷的研缽中，根據(jù)樣本量加入適當?shù)牡鞍滋崛×呀庖海x心、吸取上清，分裝一小份測定蛋白濃度，另取100μg蛋白加入5×蛋白電泳上樣液混勻，沸水浴處理5min、離心，取上樣，加蛋白Marker(Fermentas公司)，電泳；電轉(zhuǎn)至NC膜(Millipore公司)，將膜取下，剪角后封閉，孵育一抗，HIF-1α、MMP-9、TGF-β1目的蛋白抗體均按1:300稀釋，4℃過夜，鼠抗GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參，照按1:10 000稀釋后4℃過夜；孵育二抗(目的蛋白羊抗兔1:2000，內(nèi)參羊抗鼠1:2000)，室溫1h；洗膜，壓片，顯影，檢測特異性蛋白條帶。凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶的面積和灰度，蛋白區(qū)帶用積分灰度值(D)表達。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，并采用Pearson積差進行相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠心肌組織中AngⅡ的含量 采用放射免疫法測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Iso組及Rapa組心肌組織AngⅡ含量(139.402±4.431、132.712±5.316ng/L)均明顯高于空白對照組(31.172±7.271ng/L)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2心房肌間質(zhì)纖維化程度

2.2.1HE染色結(jié)果 空白對照組心肌細胞核間距、細胞核沿心肌束的走行以及心肌組織間質(zhì)纖維排列規(guī)整，無纖維化表現(xiàn)(圖1A)；Iso組心肌組織間質(zhì)成分增多，細胞核間距增寬，纖維化程度明顯且心肌纖維走行紊亂(圖1B)；與Iso組比較，Rapa組細胞核走行、心肌組織間質(zhì)纖維增多程度以及間質(zhì)纖維排列不規(guī)則程度均呈一定程度減輕(圖1C)。

2.2.2Masson染色結(jié)果及CVF比較 光鏡下可見正常心肌組織間質(zhì)膠原成分呈現(xiàn)綠色(用亮綠復染)，胞核呈現(xiàn)藍色，心肌纖維、胞質(zhì)以及紅細胞呈紅色。將圖片進行分析，按前述方法計算心房纖維化程度(以CVF為指標)，各組取平均值作為測量值。空白對照組CVF為15.482%±0.837%，無心房纖維化，而Rapa組、Iso組CVF分別為16.730%±1.052%、86.704%±1.928%，Rapa組較Iso組的心房纖維化程度明顯減弱(P＜0.01)，Rapa組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1D－F)。

圖1 各組心房肌間質(zhì)纖維化表現(xiàn)(×400)Fig. 1 Manifestation of atrial myocardial interstitial fibrosis (×400)A,D. Control group; B,E. Iso group; C,F. Rapa group. A－C. HE staining; D－F. Masson staining. Green represents myocardial interstitial collagen component

2.3免疫組織化學檢測結(jié)果 光鏡下可見正常心肌細胞(對照組)中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9均表達于胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色(圖2)。Iso組HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表達較空白對照組明顯增加，而Rapa組HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表達較Iso組明顯減少。

2.4Western blotting檢測結(jié)果 Iso組大鼠心肌組織中HIF-1α蛋白表達水平(0.579±0.025)明顯高于空白對照組(0.293±0.015)和Rapa組(0.281±0.023，P＜0.01)，Rapa組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Iso組大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達水平(1.446±0.085)明顯高于空白對照組(0.661±0.044)及Rapa組(0.678±0.031，P＜0.01)，Rapa組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Iso組大鼠心肌組織中MMP-9蛋白表達水平(1.751±0.086)明顯高于空白對照組(1.159±0.145)及Rapa組(1.152±0.162，P＜0.01)，Rapa組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3)。

2.5HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表達水平與肌纖維化程度的關系 心肌組織中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表達量均與心房纖維化程度(以CVF為評價指標)呈正相關關系(r值分別為0.987、0.988、0.917，P＜0.01)；HIF-1α與TGF-β1、MMP-9蛋白表達量亦呈正相關(r=0.976、0.901，P＜0.01)；MMP-9與TGF-β1蛋白表達量呈正相關(r=0.912，P＜0.01)。

3 討 論

多數(shù)研究表明，在AF時腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)被激活，此時作為循環(huán)和局部組織中RAAS的主要效應分子[8]，Ang Ⅱ含量增加并可最終誘導產(chǎn)生心房纖維化[2]。本實驗中大鼠皮下多點大劑量連續(xù)注射Iso 7d，結(jié)果顯示Iso組及Rapa組心肌組織中AngⅡ的含量均明顯高于空白對照組，說明給予Iso注射后，RAAS啟動，心肌組織中Ang Ⅱ表達增加，同時組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)空白對照組無心房纖維化，而Iso組心肌間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化，表明AngⅡ在心肌組織中的高表達參與了心房纖維化的形成，這一結(jié)果與我們之前的研究[9]一致。

圖2 各組心肌細胞中HIF-1α、TGF-β1、MMP-9表達量的比較(免疫組化 ×400)Fig. 2 Comparison of expression of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 in myocardial cells (Immunohistochemisty ×400)

圖3 各組心肌組織中 HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白的表達(Western blotting)Fig. 3 Protein expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 in myocardial cells (Western blotting)A. Control group; B. Iso group; C. Rapa group

HIF-1α作為組織缺氧的指標產(chǎn)物，在組織缺氧時表達增多[10]。已有研究表明，Ang Ⅱ可使HIF-1α的表達升高并參與腎纖維化過程[5]。HIF-1α蛋白的高表達還參與肝纖維化[11]、肺纖維化[12]、腎纖維化[13]過程。AF狀態(tài)下，快速心室率導致心房組織缺氧，心肌中HIF-1α表達增加并可能參與心房纖維化等心肌組織結(jié)構(gòu)改變[14]。本研究從病理學表現(xiàn)、蛋白水平等方面進行分析發(fā)現(xiàn)：Iso組中HIF-1α表達明顯高于空白對照組，同時給予HIF-1α抑制劑雷帕霉素干預后，Rapa組中HIF-1α表達明顯下降，且均與心肌纖維化程度(CVF)呈正相關，提示HIF-1α表達增加參與了Iso誘導的心房纖維化形成。已有研究證實，雷帕霉素可減緩腎臟纖維化進展[15]，本研究亦發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可抑制心房纖維化，其機制可能為：哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種重要的信號轉(zhuǎn)導分子[16]，在纖維化損傷中起重要作用[17]，而雷帕霉素能強烈抑制mTOR蛋白酶的催化活性[18]，使其下游底物的磷酸化減弱或消失，阻斷多種因子信號的下傳，同時HIF-1α也是mTOR的下游作用靶點[19]，因此，雷帕霉素可能是通過抑制HIF-1α的表達而減輕心房纖維化。

TGF-β1作為Ang Ⅱ下游區(qū)的因子之一[20]，與心肌纖維化的發(fā)生有關[21]，且HIF-1α與TGF-β1關系密切，可調(diào)控TGF-β1的表達[22]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：Iso組TGF-β1蛋白表達明顯高于空白對照組，而Rapa組中TGF-β1蛋白表達明顯降低，同時，其表達與HIF-1α及心肌纖維化程度呈均呈正相關，提示在Iso誘導的心房纖維化過程中，HIF-1α升高引起的TGF-β1表達增加可能是其重要機制之一。

MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要一員，與心肌基質(zhì)的重構(gòu)有關[23-24]，其活性升高可加重心肌纖維化[25]，而Ang Ⅱ可使MMP-9的表達增加并參與心房纖維化的形成[25]，這與本研究結(jié)果相似。TGF-β1與MMPs密切相關，并可在基因水平調(diào)控MMP-9的轉(zhuǎn)錄[26]，誘導其合成[27]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，Iso組MMP-9蛋白表達明顯高于空白對照組，而Rapa組MMP-9蛋白表達明顯降低，且其表達與TGF-β1及心肌纖維化程度呈正相關，提示在Iso誘導的心房纖維化過程中，TGF-β1升高引起的MMP-9升高可能是其重要機制之一。

已有研究證實，AF患者心房中HIF-1α水平升高與MMP-9的表達增加有關[28]。本研究中，Iso組HIF-1α及MMP-9蛋白表達均明顯增高，二者呈正相關，且與心房纖維化程度亦呈正相關，進一步表明HIF-1α可通過調(diào)節(jié)MMP-9的表達而參與心肌纖維化的形成，在該過程中，TGF-β1的調(diào)節(jié)可能發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示在Iso誘導的心房纖維化模型中，Ang Ⅱ、HIF-1α、TGF-β1及MMP-9均呈高表達，而雷帕霉素可通過抑制HIF-1α的表達而使TGF-β1和MMP-9的表達降低，心肌纖維化程度亦隨之減輕，加之它們之間存在上述調(diào)控關系，由此可以推斷，在Iso誘導的心房纖維化過程中，可能存在Ang Ⅱ/HIF-1α/TGF-β1/MMP-9這樣一條信號傳導通路，且雷帕霉素具有抗心房肌纖維化的作用，但具體的機制有待進一步研究，而這一結(jié)果為AF發(fā)病機制的深入研究及AF治療藥物的研發(fā)提供了新的方向。

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Expression and its significance of hypoxia-inducing factor-1α in rats with isoproterenol-induced atrial fibrosis

SU Fang-ju1, ZHANG Wei-ze2*, MA Ling2, WANG Fei2, ZHAO Xiao-hua2, AO Xue-ling2, LIU Yan21
Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
2Department of Cardiology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China

ObjectiveTo explore the expression of hypoxia-inducing factor-1α (HIF-1α) and its significance in the rats with isoproterenol-induced atrial fibrosis.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into control group, isoproterenol [Iso, 5mg/(kg.d) for 7 days] group, and Iso + sirolimus (Rapa) group. The atrial fibrosis rat model was reproduced by subcutaneous injection of high doses of Iso in Iso group and Rapa group. Rats were treated with isoproterenol plus sirolimus in Iso-si group. All the animals were sacrificed 15 days after treatment. The contents of angiotensinⅡ(AngⅡ) in rat myocardial tissue were determined by radioimmunoassay. HE staining and Masson staining were performed for the measurement of the degree of atrial fibrosis in terms of collagen volume fraction (CVF). Immunohistochemistry and Western blotting were performed to detect the expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9. The correlations of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 to CVF and expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were analyzed.ResultsThe AngⅡ content was significantly higher in Iso group and Rapa group than that in control group (P＜0.01). No atrial fibrosis occurred in control group (CVF was 15.482%±0.837%), and the atrial fibrosis was significantly milder in Rapa group (CVF was 16.730%±1.052%) than in Iso group (CVF was 86.704%±1.928%,P＜0.01). Immunohistochemistry and Western blotting revealed that expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were significantly increased in Iso group compared with that of control group (P＜0.01), but the expressions were significantly decreased in Rapa group compared with that in Iso group (P＜0.01). The expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were positively correlated with the fibrosis degree (P＜0.01); the HIF-1α content was positively correlated with the contents of TGF-β1and MMP-9 (P＜0.01); the MMP-9 content was positively correlated with the TGF-β1content (P＜0.01).ConclusionAngⅡ, HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 play an important role during the development of isoproterenol-induced atrial fibrosis in rats.

hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit; heart atria; fibrosis; transforming growth factor β1; matrix metallopmteinases 9

, E-mail: zhangzwz@medmail.com.cn

2013-01-15；

2013-03-25)

(責任編輯：張小利)

蘇芳菊，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師。主要從事心血管疾病的基礎與臨床研究

710032 西安 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內(nèi)科(蘇芳菊)；730050 蘭州 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院心內(nèi)科(張衛(wèi)澤、馬凌、王菲、趙小華、敖雪玲、劉燕)

張衛(wèi)澤，E-mail：zhangzwz@medmail.com.cn

R542.23

A

0577-7402(2013)05-0363-06*