席廣民，李 龍，姜 晨，傅一鳴，楊曉蕾，于 雷

(1 齊魯師范學院，濟南 250000;2 泰安市腫瘤防治院;3 濟南市婦幼保健院;4 山東萬杰醫(yī)院)

人腦膠質瘤是顱內最常見腫瘤，膠質瘤的生物學行為顯示高度惡性，在腦內多呈浸潤性生長，與正常腦組織無明確的邊界，因而單純的手術切除往往不能阻斷腫瘤的進展和復發(fā)，5年存活率為20%～30%［1，2］。放射治療是對腦膠質瘤有效的輔助治療，但腦膠質瘤細胞對常規(guī)的放療有很強的抵抗能力。因此，對膠質瘤輻射抗性的研究意義重大。在腫瘤的發(fā)生和進展過程中，經(jīng)常會伴有磷酯酰肌醇3 激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路的異常改變。PI3K 信號通路可介導多種胞外刺激，而Akt 是其關鍵的下游信號傳導分子，Akt 活化后可啟動一系列生物反應，包括細胞的生長、增殖，細胞的轉移以及血管的生成等［3］。因此，該信號通路成為人們感興趣的分子治療靶標。在本實驗中，我們研究了PI3K 信號通路中關鍵信號分子Akt在腦膠質瘤中的活化情況，并探討了PI3K/Akt 信號通路的激活與腦膠質瘤放射敏感性之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年4月～2009年12月山東萬杰醫(yī)院手術切除的腦膠質細胞瘤石蠟標本40 份。40例患者中，男23例、女17例，年齡45～75歲、平均53.2歲。根據(jù)WHO 2000年關于神經(jīng)上皮源性腫瘤惡性程度分級標準分為:Ⅰ級11例、Ⅱ級13例、Ⅲ級11例、Ⅳ級5例。同期選擇正常腦組織標本6 份作為對照，男4例、女2例，年齡48～66歲、平均55歲。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測Akt 基因的相對表達量 取新鮮的腫瘤組織，離體后凍于液氮中，轉入－80 ℃保存，用于提取RNA。按照Trizol 試劑說明書操作步驟提取組織總RNA。以總RNA 為模板，加入隨機引物和MMLV，逆轉錄成cDNA。將逆轉后的cDNA 稀釋4 倍后作為模板，用SYBR Premix Ex Taq 在ABI PRISM 7700機器上進行定量PCR。未加cDNA 管作陰性對照。反應條件如下:95 ℃10 s，95 ℃5 s，59 ℃12 s，72 ℃20 s，40個循環(huán)。用GAPDH 作為內參，2-ΔΔCT作為比較基因表達變化的方法?；虻谋磉_水平變化2 倍及以上作為基因表達增高或降低的標準。

1.2.2 免疫組化檢測pAkt 蛋白的表達 選擇腦膠質細胞瘤、正常腦組織石蠟標本，常規(guī)固定、石蠟包埋后切成4 μm 切片。組織切片脫蠟至水;3% H2O210 min 消除內源性過氧化物酶，微波爐抗原熱修復15 min;PBS 洗5 min×3 次;使用10%正常山羊血清，37℃孵育15 min 進行封閉，甩干血清;滴加抗pAKT 抗體(Santa Cruz)，稀釋度為1∶50，4 ℃過夜。PBS 洗5 min×3 次;滴加二抗室溫孵育50 min，PBS 洗5 min×3 次;然后加辣根過氧化物酶標記的三抗，37 ℃孵育15 min，PBS 洗5 min×3 次;3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 LY294002 對X 線作用后的U87 細胞增殖的影響 取單層貼壁生長的U87 細胞，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、相對濕度為95%的孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，接種于96 孔培養(yǎng)板，設3個復孔。培養(yǎng)16～24 h，空白對照組加2.5 μmol/L的DMSO，對照組在空白對照組基礎上+5 Gy X 線照射。實驗組1、2、3 分別加入2.5、5、10 μmol/L的LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后進行5 Gy的X 線照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前4 h，加MTT 工作液(0.5 mg/mL)10 μL，4 h 后吸棄上清，加入DMSO，振蕩后用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm 波長下測定吸光度值。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以±s 表示，比較采用t 檢驗;計數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Akt mRNA 在腦膠質瘤中的表達 在mRNA水平，與正常腦組織相比，Akt 基因在腦膠質瘤中的表達增高5.8 倍(P＜0.01)。

2.2 pAkt 蛋白在腦膠質瘤中的表達 免疫組化顯示腦膠質瘤中pAkt 蛋白在胞核和胞質中均有表達。pAkt 在72.5%的腦膠質瘤組織中陽性表達。正常組織中僅14.3%的表達。見圖1。

圖1 pAkt 蛋白在正常腦組織及腦腦質瘤組織中的表達

2.3 pAkt 蛋白的表達與臨床病理分級之間的關系見表1。

表1 pAkt的表達與臨床病理分級的關系(例)

2.4 LY294002 對輻射誘導的U87 細胞增殖抑制作用 LY294002 能明顯提高輻射對腦膠質瘤細胞U87的增殖抑制作用，2.5、5、10 μmol/L的LY294002 分別使5 Gy X 線照射的細胞存活率從76.0% 降至61.0%、49.0%、37.6%。見圖2。

圖2 LY294002 對輻射誘導的U87 細胞增殖抑制作用

3 討論

腦膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的多步驟演變過程，如表皮生長因子受體(EGFR)基因擴增和過表達就是惡性膠質瘤發(fā)生的一個早期事件［4］。EGFR的過表達可以通過激活PI3K/Akt 信號通路而引起細胞的增殖和轉移［5］。Chiariello 等［6］研究顯示，59%的原發(fā)性膠質母細胞瘤標本中存在PTEN 位點的雜合性缺失，PTEN 突變或缺失后會導致細胞內PI3K 通路的激活，從而活化其下游的蛋白激酶Akt。Akt 被PI3K 磷酸化激活以后，在腫瘤細胞的增殖和侵襲性生長中發(fā)揮了關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)無論在mRNA 水平，還是在蛋白水平，Akt在膠質瘤中的表達都明顯高于正常腦組織，表明Akt在腦膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

腦膠質瘤的術后治療是延長患者生存期的關鍵，放射治療是腦膠質瘤的有效輔助治療手段，如何提高腫瘤組織的放射敏感性，增強正常組織的放射抗性是當前腫瘤放射生物學及臨床放療研究的熱點。已有研究表明PI3K/Akt 信號通路的激活與腫瘤細胞的放射敏感性相關。Tomita 等［7］發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路阻斷劑Wortmannin 阻斷該信號通路后，可以明顯提高體外培養(yǎng)的中國倉鼠細胞V79 對X 線的敏感性，Cataldi 等［8］發(fā)現(xiàn)，當用15 Gy 電離照射Friend 紅白血病細胞時，PI3K/Akt 信號通路可以被激活，當用Wortmannin 或LY294002 抑制該通路后，細胞對輻射敏感性明顯增高。在本研究中，我們采用PI3K的特異性抑制劑LY294002 抑制PI3K 信號通路，它可以通透細胞，特異性抑制PI3K的激酶活性，抑制Akt的磷酸化［9］，分別用2.5、5、10 μmol/L的LY294002 阻斷PI3K/Akt 信號通路以后，發(fā)現(xiàn)腦膠質瘤細胞U87 對X 線照射的敏感性明顯增加，顯示PI3K/Akt 信號通路的激活參與了腦膠質瘤細胞對放射的耐受性。

PI3K/Akt 信號通路可以通過多種機制來提高腦膠質瘤細胞對放射的耐受性。電離輻射所引起的DNA 雙鏈斷裂是一種嚴重的致死性DNA 損傷，其修復除了依賴重組修復之外，另外一種重要的修復機制是非同源末端連接，DNA-PKcs 是該修復過程中的重要蛋白［10］，PI3K/Akt 信號通路可以通過提高DNAPKcs的表達，來提高腫瘤細胞的損傷修復能力［11］。另外，PI3K/Akt 通路活化后，也可以通過DNA 修復相關酶——DNA 聚合酶β的活性，提高腫瘤細胞的DNA 損傷修復能力［8］。此外，Zhong 等［12］的研究顯示，腫瘤被輻射后，殘余的腫瘤細胞通常處于乏氧環(huán)境，低氧誘導因子-1(HIF-1)在提高腫瘤細胞對乏氧環(huán)境的適應方面發(fā)揮重要作用，HIF-1 所調控的基因表達需要依賴PI3K/Akt 信號通路的活化。PI3K/Akt活化后也可以抑制輻射誘導的細胞凋亡，pAkt 可以通過磷酸化Bad 和Caspase9 而抑制細胞凋亡［13］。Diehl 等［14］發(fā)現(xiàn)，Akt 活化后也可以提高cyclinD1的穩(wěn)定性，促進細胞周期從G1期向S 期轉變，促進細胞增殖。Edwards 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號通路阻斷后可以提高腫瘤血管內皮細胞對輻射的敏感性，增強輻射對腫瘤血管的破壞，當把LY294002 和輻射聯(lián)用時，可以明顯延長腫瘤復發(fā)的時間。

綜上所述，PI3K/Akt 信號通路與腦膠質瘤細胞的輻射敏感性密切相關，該通路可以通過多種機制影響腫瘤細胞對輻射的敏感性，該通路的一些信號阻斷劑可能會為放射治療腦膠質瘤提供新型的放射增敏藥物。

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