吳印濤，邱寶安

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100036)

MircoRNAs (miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)20～24 nt。它是由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)約70～80 nt的單鏈RNA 前體經(jīng)過(guò)Dicer 酶加工后生成［1］。異常的miRNAs 表達(dá)可能與人類許多疾病乃至腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)［2～5］。原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、預(yù)后差、病死率高，主要死因是肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［6，7］。近年研究表明，miRNAs 在正常肝組織及肝癌組織中的表達(dá)明顯不同，且多數(shù)miRNAs 基因位于與腫瘤形成相關(guān)性脆弱基因的位點(diǎn)，它可能參與了肝細(xì)胞癌變的病理過(guò)程［8］。2007～2010年，我們檢測(cè)了大鼠肝癌細(xì)胞和大鼠胚胎肝細(xì)胞中miRNAs 表達(dá)差異譜，旨在為進(jìn)一步研究miRNAs 在HCC 發(fā)生機(jī)制中的調(diào)控作用提供有益的新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝癌細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的F334 大鼠原代肝癌細(xì)胞系，大鼠胚胎肝細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的F334 大鼠原代胎肝細(xì)胞系。細(xì)胞總RNA 抽提試劑Trizol (Invitrogen 公司)，標(biāo)記試劑盒、芯片雜交試劑盒、miRNA 芯片洗染試劑盒等(Exiqon 公司)。Agilent G2505B 型掃描儀，Genepix軟件以及SAM 3.0 軟件數(shù)據(jù)分析軟件(Exiqon 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HCC 模型的建立 取體質(zhì)量150～200 g 雄性近交系F334 大鼠150 只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各75 只，實(shí)驗(yàn)組飼以含二乙基亞硝胺(0.15% DEN)飲水，連續(xù)12 周后改為自由飲水。對(duì)照組常規(guī)自由飲水。12 周后，實(shí)驗(yàn)組大體解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)地較硬、滿布大小不等的癌結(jié)節(jié)(圖1 A)。HE 染色結(jié)果符合HCC 病理改變，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，各種異常的肝細(xì)胞構(gòu)成增生結(jié)節(jié)，并且伴有纖維結(jié)締組織增生(圖1 B)。原代接種24 h 后可見由3～5個(gè)細(xì)胞組成的上皮樣細(xì)胞克隆，7 d 后發(fā)現(xiàn)由大量細(xì)胞形成穩(wěn)定的克隆團(tuán)塊，形態(tài)呈多邊形，邊緣清晰明確(圖1 C)。

圖1 大鼠HCC 模型及細(xì)胞原代培養(yǎng)

1.2.2 原代培養(yǎng) 取大鼠肝癌組織及胚齡14 d 大鼠胚胎肝臟組織，將其剪成1 mm3左右的小塊，放入三角燒瓶中，加入40 倍體積的膠原酶，密封燒瓶。將燒瓶放入37 ℃的恒溫振蕩水浴箱中，消化20 min，待組織完全分散后(如組織塊較大未充分消化可用100 目鋼網(wǎng)過(guò)濾)，1 000 r/min 離心，5 min 后，去除上清，用Hank's 液離心漂洗1～2 次，去除上清，加William's E 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。注意及時(shí)觀察換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋瓶底80%時(shí)，在顯微鏡下挑取單克隆細(xì)胞島進(jìn)行傳代擴(kuò)增。

1.2.3 RNA的提取、分離和標(biāo)記 大鼠肝癌細(xì)胞和大鼠胚胎肝細(xì)胞用含10%胎牛血清的William's E 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。經(jīng)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、80%融合狀態(tài)時(shí)收獲107細(xì)胞。Trizol 一步法提取細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)異丙醇沉淀法濃縮RNA，用紫外分光光度計(jì)定量，甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)總RNA 樣本的質(zhì)量。肝癌細(xì)胞中提取總RNA 63.48 μg，胚胎肝細(xì)胞中提取總RNA 83.57 μg。根據(jù)RNA 在A260/280 值≥1.7，以及甲醛變性凝膠電泳28 s、18 s rRNA，條帶清晰，亮度比值接近2∶1，滿足miRNA 芯片實(shí)驗(yàn)的要求。然后，取0.25～1 μg 總RNA 利用Hy3 進(jìn)行熒光標(biāo)記，待溶液完全溶解無(wú)沉淀后可進(jìn)行芯片雜交。

1.2.4 基因芯片的雜交、清洗和掃描 將帶有熒光標(biāo)記的RNA 溶于400 μL 雜交液中，滴加到Agilent的蓋片上，于56 ℃轉(zhuǎn)動(dòng)雜交16 h。雜交結(jié)束后，于56 ℃分別在Wash buffer A 、Wash buffer B 及Wash buffer C 中各洗滌2 min，而后在裝有無(wú)RNAase 水的液體中漂洗1 s，最后200 g 離心5 min 干燥。芯片使用Agilent G2505B 型掃描儀進(jìn)行圖像掃描，得到芯片雜交圖譜。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將雜交圖譜在Genepix 軟件中打開，根據(jù)芯片名稱及研究物種，導(dǎo)入相應(yīng)的GAL(Genepix Arrat List)文件，將陣列模板與芯片圖譜中的陣列逐樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)起來(lái)，抓取信號(hào)數(shù)據(jù)，再對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAM3.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

miRNA 在大鼠肝癌細(xì)胞與胚胎肝細(xì)胞中的差異性表達(dá)見圖2。與大鼠胚胎肝細(xì)胞相比，有78個(gè)miRNAs 在肝癌細(xì)胞中有表達(dá)差異，包括68個(gè)表達(dá)上調(diào)和10個(gè)表達(dá)下調(diào)。部分下調(diào)表達(dá)差異較為顯著的miRNAs 見表1。

表1 部分下調(diào)表達(dá)差異較為顯著的miRNAs

3 討論

圖2 SAM 軟件分析結(jié)果

miRNA 是一種廣泛存在于真核生物中，大小為20～24 nt的小分子單鏈非編碼的RNA，其進(jìn)化過(guò)程高度保守，并且在細(xì)胞中呈明顯的時(shí)序性表達(dá)模式，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程［9］。多數(shù)miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性［10，11］，雖然這些miRNAs的生物學(xué)功能目前還不十分清楚，但是miRNA的調(diào)控作用很可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它需要接受某些信號(hào)的刺激，從整體上調(diào)控有機(jī)體的生命活動(dòng)［12，13］。大量研究證據(jù)表明，miRNAs 在HCC的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，并且直接參與了肝癌細(xì)胞的分化、凋亡、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miRNAs 是通過(guò)與其靶mRNA 分子的3'端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體［14］，然后作用于靶點(diǎn)mRNA，通過(guò)對(duì)mRNA 剪切或抑制翻譯過(guò)程而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［15］。miRNA 與靶mRNA 完全互補(bǔ)時(shí)，mRNA 將發(fā)生特異性降解;兩者不完全互補(bǔ)時(shí)，抑制了mRNA的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)情況兩者并不完全互補(bǔ)，所以其主要作用模式是轉(zhuǎn)錄后的翻譯阻遏。miRNA的作用具有多相性，一個(gè)miRNA 可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因，一個(gè)基因也可受多個(gè)miRNA的調(diào)控，從而形成復(fù)雜而又精準(zhǔn)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控著生物體的基因表達(dá)及功能，一旦其表達(dá)水平失衡，將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本試驗(yàn)采用哺乳動(dòng)物miRNA 芯片技術(shù)篩選出大鼠肝癌細(xì)胞與胚胎肝細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs，其證實(shí)的調(diào)節(jié)靶基因包括有參與蛋白質(zhì)合成與水解、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化與凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄、離子束縛、物質(zhì)代謝等生物生命進(jìn)程中的多個(gè)基因，其涉及到腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)方面，說(shuō)明某些關(guān)鍵的miRNAs 表達(dá)水平的失衡是HCC 發(fā)生和演進(jìn)的重要分子改變。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大鼠肝癌細(xì)胞中上調(diào)的miRNAs 與下調(diào)的比值約為68∶10，提示大鼠肝癌細(xì)胞中的癌基因、抑癌基因共同作用，相互協(xié)調(diào)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變的發(fā)生。

miR-122 是一種肝臟發(fā)育的肝特異性miRNA，占成年肝臟miRNA 表達(dá)總量的70%左右，且不同物種間的表達(dá)具有高度進(jìn)化保守性［16］。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)此miRNA 在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-122 與細(xì)胞周期素(CCNG1)、抗凋亡蛋白Bcl-w、解聚素—金屬蛋白酶(ADAM17)關(guān)系密切。Gramantieri 等［17］研究認(rèn)為，miR-122 通過(guò)抑制CCNG1的表達(dá)達(dá)到維持染色體穩(wěn)定、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，在HCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演著腫瘤抑制物的角色。眾所周知，Bcl-2 蛋白家族在調(diào)控線粒體凋亡信號(hào)上有非常重要的作用。Lin 等［18］發(fā)現(xiàn)，miR-122 以Bcl-w 為直接靶點(diǎn)，介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡通路，激活細(xì)胞凋亡蛋白3，從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。ADAM17 參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)沉默可使肝癌細(xì)胞在體外遷移和轉(zhuǎn)移能力、在體內(nèi)血管生成及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力急劇下降［19］。miR-122 可通過(guò)抑制ADAM17的表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此可認(rèn)為miR-122 起到了抑癌基因的作用。

上述研究結(jié)果表明，miRNAs 在胎肝細(xì)胞向肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程中扮演著十分重要的角色，類似于癌基因和抑癌基因的作用，這就有可能為闡明肝細(xì)胞癌變的分子機(jī)制提供一條新的思路。Li 等［20］對(duì)120例HCC 患者血清miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)利用異常表達(dá)的miR-375 診斷HCC 特異度達(dá)96%，敏感度達(dá)100%。我們?cè)O(shè)想，如果能夠獲得一種miRNA 穩(wěn)定表達(dá)的途徑，如血液、唾液等，那么液相芯片技術(shù)將因其具有高通量、方便、快速與經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，極可能成為一種大規(guī)模診斷腫瘤的方法。由于HCC 是多基因疾病，針對(duì)多個(gè)HCC 過(guò)度表達(dá)的基因設(shè)計(jì)特異性miRNA，同時(shí)多靶點(diǎn)沉默多個(gè)癌基因、多靶點(diǎn)作用于信號(hào)通道和分子靶點(diǎn)，從而達(dá)到全面的治療效果，這無(wú)疑也將成為HCC 靶向治療新的研發(fā)方向。

總之，本研究利用miRNA 芯片技術(shù)和生物信息學(xué)的方法，篩選出大鼠肝癌細(xì)胞和胚胎肝細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究miRNAs 在肝細(xì)胞癌變分子機(jī)制中的調(diào)控作用提供了有用的數(shù)據(jù)庫(kù)，而對(duì)篩選出的差異miRNAs 進(jìn)行驗(yàn)證和功能學(xué)的研究則是下一步開展的工作。同時(shí)結(jié)合臨床上不同的HCC 病理類型、惡性程度、分期、分級(jí)等特征，研究其miRNAs的差異表達(dá)譜，是否能成為HCC的個(gè)體化治療及判斷愈后的重要指標(biāo)將是本實(shí)驗(yàn)室未來(lái)的研究方向。

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