崔鴻江，巴德瑪，林 燕

1內(nèi)蒙古醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，呼和浩特 010030;2內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗所，呼和浩特 010010

刺柏為柏科植物杜松(Juniperus rigida Si eb.Et Zucc.)的干燥嫩枝葉，為蒙醫(yī)臨床常用藥，具清腎熱、利尿、燥“協(xié)日烏素”愈傷止血等功效，主要用于治療尿血、尿道疼痛、炭疽、風濕、腎“達日干”、“協(xié)日烏素”等病癥［1］。該品種質(zhì)量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》蒙藥分冊，其中未規(guī)定含量測定項。為提高蒙藥材質(zhì)量標準，根據(jù)國家藥典委員會專家的建議，對刺柏葉中主要活性成分之一槲皮苷，采用高效液相色譜法進行了含量測定研究，經(jīng)實驗條件摸索，結(jié)果達到了較好的液相色譜分離效果，方法簡便，重復性好，可作為控制刺柏葉藥材內(nèi)在質(zhì)量的有效方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀(帶SPDM20A型二極管陣列檢測器);Sartoriμs ME5型電子天平;Mettler AE-100電子天平;PL203型電子天平。

1.2 試劑與試藥

槲皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:111538-200302)，甲醇為色譜純，其他均為分析純試劑，水為離子交換高純水。

1.3 供試樣品

刺柏葉藥材分別由內(nèi)蒙古自治區(qū)錫盟蒙醫(yī)研究所(1號)、內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院(2號)、內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟蒙醫(yī)醫(yī)院(3號)和內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟正藍旗(4號)提供，經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗所康雙龍、周凱兩位國家藥典委員會委員鑒定為柏科植物杜松(Juniperus rigida Si eb.Et Zucc.)的干燥嫩枝葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，本實驗研究采用Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱和Shim-Pack C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱。

2.1.2 流動相的選擇

參照《中國藥典》［2］“側(cè)柏葉”含量測定項下的方法，采用甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液-冰醋酸(40∶60∶1.5)作為流動相，分離效果好、保留時間適中，流速:1.0 mL/min。在選定條件下，槲皮苷峰與樣品中其他組分色譜峰可達基線分離，分離度大于1.5;按槲皮苷峰計算，理論塔板數(shù)在3000以上。色譜圖見圖1、2。

2.1.3 柱溫

本實驗對30℃和40℃柱溫進行了考察，結(jié)果保留時間略有差異，但分離度及理論板數(shù)沒有變化，從資源角度考慮，故本實驗研究將柱溫定為30℃。

2.1.4 檢測波長的選擇

取槲皮苷對照品溶液，通過二極管陣列檢測器對槲皮苷自200～800 nm進行光譜掃描，結(jié)果槲皮苷在255 nm處有吸收峰，結(jié)合《中國藥典》2010年版一部“側(cè)柏葉”含量測定項下的條件，故選擇254 nm作為檢測波長。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對照品適量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過2號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流45 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取槲皮苷對照品2.010 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2、5、10、15、20、30 μL 注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積對進樣量進行回歸分析，繪制標準曲線，其回歸方程為:Y=2776.56X+3349.05，r=0.9998。結(jié)果表明:在上述色譜條件下，槲皮苷進樣量在40.2 ng～603.0 ng范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

取同一地區(qū)的供試品(1號樣)6份，各約0.4 g，精密稱定，分別按上述供試品溶液的制備和色譜條件進行測定，進樣量各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定每份含量，求得槲皮苷平均含量為2.23 mg/g，結(jié)果 RSD為0.12%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取刺柏葉供試品(1號樣)6份樣品，按供試品溶液制備方法操作，每份進樣2次，每次進樣量為20 μL，計算槲皮苷的含量及相對標準偏差，結(jié)果RSD為1.82%，表明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗

取同一供試品(含槲皮苷2.23 mg/g)6份，各約0.1 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，各精密加入對照品溶液10 mL(槲皮苷濃度為0.02216 mg/mL)，再分別精密加甲醇10 mL，按上述供試品溶液的制備和色譜條件進行測定，試驗結(jié)果表明，槲皮苷平均回收率為 100.45%(n=6)，RSD 為 0.69%。說明該測定方法測定結(jié)果準確。回收率試驗結(jié)果見表1。

2.7 耐用性試驗

2.7.1 色譜柱的考察

換不同廠家、不同型號的色譜柱，按確定的色譜條件，取精密度試驗中的同一份供試品溶液進行測定，平均含量分別為:2.232 mg/g 和 2.139 mg/g，相對偏差為2.12%。結(jié)果表明，該方法對不同型號的色譜柱有較好的耐用性。

表1 槲皮苷加樣回收率試驗Table 1 Results of recovery tests

2.7.2 穩(wěn)定性試驗

在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，然后每隔6 h測定1次，考察24 h，再于48 h考察1次。結(jié)果表明，對照品和供試品溶液至少在48 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，槲皮苷對照品峰面積的 RSD為0.23%(n=6)，供試品中槲皮苷峰面積的RSD為0.38%(n=6)。

2.8 樣品的含量測定

取4批樣品各0.2 g，精密稱定，照供試品溶液制備項下操作，制成供試品溶液。在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀測定，并計算各樣品中槲皮苷含量(按干燥品計算)。測定結(jié)果見表2。

表2 樣品中槲皮苷的含量測定結(jié)果Table 2 Quantification results of quercitrin in samples from different sources

3 討論

3.1 測定方法的選擇

蒙藥材刺柏葉的質(zhì)量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》蒙藥分冊，其中未規(guī)定含量測定項，檢測項目無法滿足目前的質(zhì)量控制要求，因此，為進一步提高蒙藥材的質(zhì)量標準，根據(jù)國家藥典委員會的建議，我們首次對該品種進行了高效液相色譜法的研究，結(jié)果達到了較好的液相色譜分離效果，方法簡便，重復性好，可作為控制刺柏葉藥材內(nèi)在質(zhì)量的有效方法。

3.2 提取溶劑的選擇

文獻報道［3］槲皮苷溶于乙醇，堿性水溶液，幾乎不溶于冷水、乙醚中，曾使用甲醇、乙醇作溶劑進行提取，結(jié)果均可檢出槲皮苷成分，而用甲醇作為提取溶劑，易過濾，干擾成分少，結(jié)合《中國藥典》“側(cè)柏葉”含量測定項下的方法，本實驗選擇甲醇為提取溶劑。

3.3 提取效率考察

本實驗分別考察回流提取時間為20、30、45、60、90、120 min六個不同提取時間點對含量結(jié)果的影響，結(jié)果顯示回流提取時間45 min時含量達到最大值，再繼續(xù)回流提取，含量基本不再增加，為了節(jié)約能源，提高實驗效率，故本實驗選擇回流提取時間為45 min。

3.4 指標成分的選擇

選擇具有抗病毒作用的槲皮苷［3］，作為含量測定的指標成分，采用HPLC測定其含量，方法簡便，結(jié)果準確，穩(wěn)定性好，可有效控制蒙藥材刺柏葉的內(nèi)在質(zhì)量。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Drug Standard of Ministry of Health of the People's Republic of China《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》Mongolian Medicine Volume(蒙藥分冊).Beijing:Chemical Industry Press，1998.23.

2 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010，I:200.

3 State Administration of Traditional Chinese herbal medicine Information Center station(國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站).Herbal effective ingredients manual(植物藥有效成分手冊).Beijing:People's Health Press，1986.877.