張 云，周 瀟，宋永相，陳蕓蕓，黃洪波，李 潔，華 燕，鞠建華*

1中國科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院海洋微生物中心中國科學(xué)院南海海洋研究所廣州 510301;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049;3西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224;4中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006

廣袤的海洋蘊(yùn)藏著豐富的、有待開發(fā)的生物資源。近年來，隨著對(duì)海洋認(rèn)識(shí)的不斷深入，以及海洋科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們提出了“向海洋要藥”的口號(hào)。海洋微生物廣泛棲息于海洋動(dòng)植物、海水及海底沉積物中。海洋迥異于陸地的環(huán)境及生態(tài)系統(tǒng)賦予海洋微生物在生理性狀和遺傳背景上以特殊性和多樣性，導(dǎo)致其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣性、新穎性，活性特殊性、顯著性［1］，這為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了重要的先導(dǎo)化合物。

海洋放線菌是重要的藥源微生物，人們從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗菌、抗腫瘤、抗瘧疾、抗炎等活性的大環(huán)內(nèi)酯類、醌類和生物堿類等新結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物［2，3］。近年從我國南海海域的海底沉積物中也發(fā)現(xiàn)了許多新的放線菌資源［4-6］。隨著深?？碧胶秃５鬃鳂I(yè)技術(shù)的提高，人們把探索的目光從近海淺海轉(zhuǎn)向深海大洋，從深海海底沉積物中發(fā)現(xiàn)了許多不同于陸地或淺海的新的海洋放線菌類群［4，7］。本課題組一直致力于海洋放線菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物合成方面的研究，已經(jīng)從來自于南海的海洋放線菌中分離得到了具有多樣生物活性的、結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如從海洋鏈霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666及1667中分離得到了具有抗腫瘤、抗菌活性的吲哚咔唑生物堿及替達(dá)霉素類化合物［8，9］。值得一提的是，我們從源自于南海3865米深海的放線菌新屬新種Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652中發(fā)現(xiàn)了具有抗瘧原蟲Plasmodium falciparum藥敏株3D7及耐藥株Dd2活性的β-咔啉新生物堿marinacarbolines A-D及吲哚內(nèi)酰胺類新生物堿［10］，從來源于南海3370 m水深的鏈霉菌S.lusitanus SCSIO LR32中分離得到了具有抗菌活性的芳酰胺類化合物［11］，以及具有細(xì)胞毒活性的角環(huán)素類新化合物grincamycins B-F［12］。近來，我們通過鹵蟲致死活性和抗菌活性篩選，獲得了一株發(fā)酵產(chǎn)物具較強(qiáng)抗菌及鹵蟲致死生物活性的海洋放線菌SCSIO ZJ28，該菌來源于南海3536米水深的海底沉積物，經(jīng)16S分子生物學(xué)鑒定為鏈霉菌Streptomyces albiflaviniger。本文報(bào)道該深海放線菌的分子生物學(xué)鑒定及其代謝產(chǎn)物elaiophylin(1)的發(fā)酵、分離和鑒定。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of compound 1

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Bruker AVANCE DRX 500核磁共振儀(500/125 MHz，TMS為內(nèi)標(biāo));Bruker amaZon SL離子肼質(zhì)譜儀;Varian ProStar高效液相色譜儀(配PDA檢測(cè)器);YMC-Pack ODS-A半制備色譜柱(250×10 mm，5 μm);硅膠薄層層析板(HSGF254)和柱層析用硅膠(100～200目)均為煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品;中壓制備層析系統(tǒng)EZ Purifier III(上海利穗化工科技有限公司);YMC GEL ODS-A(75 μm);色譜純乙腈(安徽時(shí)聯(lián)公司);氘代氯仿(CIL);其它化學(xué)試劑皆為國產(chǎn)分析純。

放線菌Streptomyces albiflaviniger SCSIO ZJ28分離自中國南海北部(E 120°0.250''，N 20°22.971'')水深3536 m的海底沉積物樣品，菌種保存于中國科學(xué)院海洋微生物中心。

M-AM2ab培養(yǎng)基:豆粉0.5%，酵母粉0.5%，可溶性淀粉2%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨0.2%，海鹽3%，碳酸鈣0.2%，pH 7.2 ～7.4，121 ℃滅菌 30 min 備用。

1.2 方法

1.2.1 海洋鏈霉菌SCSIO ZJ28的分子生物學(xué)鑒定

1.2.1.1 16S rRNA 基因序列的 PCR 擴(kuò)增

用細(xì)菌16S rRNA的簡(jiǎn)并引物，27F primer(5'-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3')和1492R primer(5'-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3')，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):DNA模板0.5 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，27F primer(20 μmol/L)0.5 μL，1492R primer(20 μmol/L)0.5 μL，Tap 酶(5 U·μL)0.2 μL，DMSO 1.25 μL，ddH2O 17.55 μL。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min;59℃退火1 min，72℃延伸1.5 min;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。

1.2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定

用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR產(chǎn)物，再連接到pCR2.1載體(Invitrogen)中，16S rRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定。將測(cè)出的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過CLUSTALX軟件進(jìn)行海洋鏈霉菌菌株SCSIO ZJ28及鏈霉菌屬最相似菌株的16S rRNA基因序列的對(duì)比，使用軟件MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用M-AM2ab培養(yǎng)基。種子液用250 mL錐形瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，從平板上接入適量菌種，于28℃、200 rpm的搖床上培養(yǎng)36 h后分別轉(zhuǎn)接于2 L錐形瓶，每瓶200 mL培養(yǎng)基，于28℃、200 rpm條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 鹵蟲致死活性檢測(cè)

取5 mg/mL的DMSO樣品提取物溶液5 μL，分別加入到200 μL人工海水、含有10～15個(gè)海蝦幼蟲96孔板中，同時(shí)設(shè)置DMSO空白組，室溫下，在30 min 及1，2，3，5，10，24 h 時(shí)計(jì)數(shù)海蝦幼蟲死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算致死率，以觀察鹵蟲致死活性。

1.2.4 抗菌活性檢測(cè)

取5 mg/mL的DMSO樣品提取物溶液5 μL，加到直徑為0.6 cm無菌濾紙片上，置于含枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633和大腸桿菌Escherichia coli ATCC25922的LB檢測(cè)平板，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小，判斷抑菌活性。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4000 rpm離心10 min，分離得到上清液和菌絲體部分，分別用等體積的丁酮和丙酮反復(fù)萃取4次，減壓濃縮后得到上清液和菌絲體粗提物，經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其成分相似，予以合并，得浸膏9.5 g。采用正相柱層析，氯仿/甲醇梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，8∶2，5∶5)洗脫共得到8個(gè)組份Fr.1～Fr.8?；钚宰粉欙@示亞組分Fr.4～Fr.7為活性組分，進(jìn)一步經(jīng)過中壓反相柱層析，甲醇/水梯度(100∶0～0∶100)洗脫得到組分Fr.A-1 ～Fr.A-17，通過 TLC 驗(yàn)證合并后對(duì)其中 Fr.A-15～Fr.A-17進(jìn)行常壓正相柱層析，石油醚/乙酸乙酯梯度(8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10)洗脫，再以半制備HPLC(乙腈/水75% ～100%線性洗脫30 min，流速2.5 mL/min)分離，得到化合物1(12 mg，tR=28 min)，分離收率為2 mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

菌株SCSIO ZJ28在ISP2(酵母提取粉0.4%，麥芽提取粉1%，葡萄糖0.4%，海鹽3%，pH 7.2～7.4)固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)4～5 d后，形成發(fā)達(dá)的白色氣生菌絲和淺黃褐色基生菌絲。16S rRNA基因序列(GenBank JX020704)分析表明 SCSIO ZJ28與鏈霉菌屬 S.albiflaviniger NRRL B-1356T(AJ391812)相似性較高 (99.58%)，且聚在同一個(gè)進(jìn)化分支，有較高的自舉值(88%)支持。故鑒定該菌株為S.albiflaviniger SCSIO ZJ28，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，菌落形態(tài)圖見圖3。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的SCSIO ZJ28與其他鏈霉菌菌種NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing relationship between strain SCSIO ZJ28 and closely related members of genus Streptomyces

圖3 菌株SCSIO ZJ28在ISP2培養(yǎng)基上的形態(tài)圖Fig.3 Phenotype of strain SCSIO ZJ28 on ISP2-meduim plate

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末，(+)ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z 1047.6［M+Na］+，提示其分子量為1024.6。化合物1的13C NMR僅給出了27個(gè)碳信號(hào)，故判斷化合物1存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)，進(jìn)而推測(cè)其分子式為C54H88O18?；衔锏?H及13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致［13］，故鑒定化合物1為elaiophylin。值得注意的是，文獻(xiàn)報(bào)道C-8和C-12的化學(xué)位移分別為 δ 35.9，38.9［13］，通過 HMQC 譜發(fā)現(xiàn)，δ 1.02 及2.38 的兩個(gè)質(zhì)子是連接 δ 39.0 的碳上，而 δ 1.93 的質(zhì)子是連接在δ 35.9的碳上，故C-8和C-12的化學(xué)位移應(yīng)更正為δ 39.0和35.9。在通過在甲醇溶液中培養(yǎng)，獲得了化合物1的單晶，通過X-單晶衍射確認(rèn)了化合物1的結(jié)構(gòu)(圖4)?；衔?的NMR和(+)ESI-MS數(shù)據(jù)如下:1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.65(1H，d，J=15.3 Hz，H-2)，6.98(1H，dd，J=15.3，11.2 Hz，H-3)，6.13(1H，dd，J=15.0，11.2 Hz，H-4)，5.64(1H，dd，J=15.0，10.0 Hz，H-5)，2.55(1H，m，H-6)，4.73(1H，d，J=10.4 Hz，H-7)，1.93(1H，m，H-8)，3.94(1H，m，H-9)，1.71(1H，m，H-10)，1.02(1H，overlapped，H-12)，2.38(1H，dd，J=11.9，4.5 Hz，H-12)，4.11(1H，m，H-13)，1.19(1H，m，H-14)，3.89(1H，m，H-15)，1.10(3H，d，J=6.2 Hz，H-16)，1.04(3H，d，J=7.0 Hz，H-17)，0.81(3H，d，J=6.9 Hz，H-18)，0.99(3H，d，J=7.0 Hz，H-19)，1.66(1H，m，H-20)，1.46(1H，m，H-20)，0.85(3H，t=7.6 Hz，H-21)，5.05(1H，br s，H-22)，1.79(2H，dd，J=11.4，4.8 Hz，H-23)，3.98(1H，m，H-24)，3.62(1H，m，H-25)，4.01(1H，m，H-26)，1.25(3H，d，J=6.8 Hz，H-27);13C NMR(CDCl3，125 Hz)δ:169.9(C-1)，121.0(C-2)，144.4(C-3)，132.0(C-4)，145.0(C-5)，40.9(C-6)，77.9(C-7)，35.9(C-8)，70.4(C-9)，41.8(C-10)，99.1(C-11)，39.0(C-12)，70.6(C-13)，48.5(C-14)，66.6(C-15)，19.2(C-16)，15.0(C-17)，9.3(C-18)，7.0(C-19)，19.5(C-20)，8.7(C-21)，93.3(C-22)，33.7(C-23)，65.9(C-24)，71.5(C-25)，66.1(C-26)，16.8(C-27);(+)ESI-MS m/z 1047.6［M+Na］+。

圖4 化合物1的單晶結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The X-ray structure of compound 1

2.3 討論

海洋放線菌Streptomyces albiflaviniger SCSIO ZJ28的發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗菌活性和鹵蟲致死活性，我們從中分離鑒定了一類糖基化的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素elaiophylin(1)。菌株SCSIO ZJ28成為一種產(chǎn)elaiophylin的耐鹽微生物資源。Elaiophylin已在多種鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，具有很好的抗球蟲活性，所以被用作為化學(xué)合成抗球蟲劑的前體［15，16］。該類化合物還具有抗細(xì)菌、抗真菌及細(xì)胞毒等生物活性。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道elaiophylin具有增強(qiáng)瘤胃效率及抗?jié)兊淖饔茫?7，18］。對(duì)生產(chǎn)重要生物活性化合物的產(chǎn)生菌進(jìn)行代謝工程和生物合成研究，可以提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量，構(gòu)建新結(jié)構(gòu)衍生物并發(fā)現(xiàn)新的催化機(jī)制［19-21］。在后續(xù)的工作中，我們將通過代謝工程和組合生物合成技術(shù)對(duì)elaiophylin的生物合成途經(jīng)進(jìn)行研究，獲得人工基因置換或缺失的突變菌株，以期提高化合物產(chǎn)量，或者生產(chǎn)新結(jié)構(gòu)衍生物，為新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)現(xiàn)提供先導(dǎo)化合物。

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