戴先鵬 畢國善 鄧禮明 申 昕 熊國祚 (南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科，湖南 衡陽 421001)

血管吻合口狹窄是導(dǎo)致血管手術(shù)后遠期通暢率難以提高的重要原因，其主要病理基礎(chǔ)是血管平滑肌的增殖和遷移，且發(fā)生的過程與創(chuàng)傷修復(fù)過程類似。血管損傷后的狹窄過程實際上是血管對損傷作出炎癥反應(yīng)并積極參與修復(fù)的過程〔1〕，在血管損傷后的炎癥反應(yīng)過程中，腫瘤壞死因子(TNF-)α和白介素(IL)-6充當(dāng)重要的促炎因子，可刺激血管平滑肌細胞的增殖與遷移，也可促進成纖維細胞的增生，從而引起血管內(nèi)膜的增生。小凹蛋白-1(Caveolin-1)是細胞膜上小凹的結(jié)構(gòu)蛋白，能通過“腳手架”區(qū)域的共有序列與多種信號分子相互作用，對多種信號分子和血管活性因子起著重要調(diào)節(jié)作用。Caveolin-1能調(diào)節(jié)炎癥細胞和內(nèi)皮細胞中信號傳導(dǎo)通路，影響炎癥細胞對炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，進而影響炎癥反應(yīng)過程。Caveolin-1在血管平滑肌細胞上有著豐富的表達〔2〕。多種血管活性因子促進血管平滑肌增殖時，Caveolin-1表達下降;相反，Caveolin-1表達上調(diào)可抑制血管平滑肌細胞的增殖〔3〕。本研究探討Caveolin-1對血管吻合后狹窄的作用以及與炎癥因子的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 健康成年家兔40只，雄性，體重1.5～2.0 kg，由南華大學(xué)動物實驗部提供。LipofectamineTM2000購于Invitrogen 公司，兔抗 IL-6(bs-6312R)、兔抗 TNF-α(bs-2150R)、兔抗IL-10(bs-0698R)購于北京博奧森生物科技有限公司，鏈霉親合素-生物復(fù)合物(SABC)試劑盒購于北京中杉金橋公司，鼠抗β-actin(CW0096)購于北京康為世紀公司，鼠抗Caveolin-1(#610058)購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 40只家兔根據(jù)隨機化原則分為四組。正常組(假手術(shù)組)家兔不作任何處理，手術(shù)組家兔分離剪斷右側(cè)頸總動脈后，用6-0 Prolene線間斷外翻縫合;空轉(zhuǎn)染組在血管吻合剩最后1針時注入空質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合液后縫合，局部孵育30 min;轉(zhuǎn)染組在血管吻合剩最后一針時注入配好的含pCDNA3.1-Caveolin-1和脂質(zhì)體的混合液，局部孵育30 min。于術(shù)后7、14 d將右側(cè)頸總動脈分離，仔細檢查血管吻合口情況，并觀察血管通暢無血栓形成后取標(biāo)本。其中術(shù)后7 d的標(biāo)本放入液氮中用于實時熒光定量(Real time)PCR及Western印跡檢測。術(shù)后14 d的標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定，用于免疫組化和HE染色。

1.2.2 Caveolin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配制方法 用已提取好的質(zhì)粒及LipofectamineTM2000分別稀釋于無血清培養(yǎng)基中(兩者的比例為1∶3)，室溫靜置4 min再將兩者混合室溫放置20 min。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察血管內(nèi)膜變化 取待測吻合口血管組織，甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，樹膠封片保存。光鏡下觀察血管吻合口形態(tài)。

1.2.4 Real time PCR檢測吻合口血管組織中Caveolin-1 mRNA的表達 血管組織標(biāo)本總RNA用Trizol Reagent常規(guī)提取，按試劑盒說明，MMLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用β-actin為內(nèi)參照。引物用PrimerPremier 5.0設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。Caveolin-1引物序列:上游5'-AGCATGTCTGGGGGCAAATA-3'，下游 5'-TCACAGTGAAGGTGGTGAAG C-3'，產(chǎn)物為 280 bp。PCR 總反應(yīng)體系 20 μl，含 2 × SYBR Premix Ex TaqTM 10 μl，上、下游引物 10 μmol/L 各 0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 7.2 μl。循環(huán)設(shè)置:95℃10 s，61℃ 20 s，72℃ 15 s循環(huán)38次;于95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s得融解曲線。反應(yīng)完成后，得到所有標(biāo)本的所有記錄點曲線。使用軟件對數(shù)據(jù)進行自動分析，調(diào)整基線后，計算達到閾值的最低循環(huán)數(shù)(Ct值)。

1.2.5 Western印跡檢測血管組織中Caveolin-1蛋白的表達取血管組織，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，取40 μg蛋白加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PDVF)膜。在5%脫脂牛奶中4℃封閉1 h。按1∶500加入一抗，于4℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠(按照1∶5 000比例稀釋)37℃恒溫箱中孵育45 min，TBST洗4次×15 min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒顯色并攝像分析。

1.2.6 檢測血管組織中TNF-α、IL-6、IL-10蛋白的表達 采用SABC法，操作按試劑盒說明書進行。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗所得的數(shù)據(jù)都用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔血管組織病理變化 HE染色可見，正常組血管內(nèi)膜光滑，管壁無增厚，內(nèi)彈力板完整;手術(shù)組和空轉(zhuǎn)染組血管組織內(nèi)膜、中膜增厚明顯，可見血管管腔狹窄，內(nèi)膜下平滑肌細胞明顯增生并排列不規(guī)則，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層變性水腫，彈力纖維層顯示不清;轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)膜、中膜亦可見不同程度的增厚，管腔有所狹窄，可見中膜層平滑肌細胞有較多增生，但增生程度及狹窄程度均較手術(shù)組明顯減輕。見圖1。

與轉(zhuǎn)染組(0.143±0.008)和正常組(0.078±0.014)比較，手術(shù)組(0.365±0.058)和空轉(zhuǎn)染組(0.421±0.052)的內(nèi)膜中膜面積均顯著增高(P＜0.01);轉(zhuǎn)染組雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 家兔血管組織中Caveolin-1 mRNA表達 與正常組(0.825±0.042)比較，手術(shù)組(0.107±0.019)和空轉(zhuǎn)染組(0.122±0.025)的Caveolin-1 mRNA表達降低(P＜0.05)，與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組(0.735±0.046)Caveolin-1 mRNA明顯升高(P ＜0.05)。

2.3 家兔血管組織中Caveolin-1蛋白表達 Caveolin-1在各組均有表達，與正常組(0.798±0.012)比較，手術(shù)組(0.397±0.038)和空轉(zhuǎn)染組(0.345±0.027)中Caveolin-1蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染組(0.547±0.017)Caveolin-1蛋白表達明顯高于手術(shù)組(P＜0.05)。見圖2。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測血管中TNF-α、IL-6和IL-10的表達TNF-α在內(nèi)皮和平滑肌中均有表達，手術(shù)組及空轉(zhuǎn)組表達高于正常組;而與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組表達下降。與正常組比較，手術(shù)組和空轉(zhuǎn)染組IL-6、IL-10表達明顯增高;而與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組IL-6表達明顯降低，IL-10表達升高。見圖3～圖5。

圖2 各組家兔血管組織中Caveolin-1蛋白表達情況

3 討論

Caveolin-1是修飾于Caveolae內(nèi)表面的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，該基因定位于人染色體7q31.1，包含有3個外顯子，在不同種屬間的結(jié)構(gòu)和序列都保持著高度的相似性〔4〕，在多種細胞中都有表達，主要表達于脂肪細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞等終末分化細胞〔5〕。Caveolin-1可以參與細胞內(nèi)的多種生命活動，如膽固醇的轉(zhuǎn)運、細胞轉(zhuǎn)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞膜的組裝、血管生成和腫瘤形成等。近來的研究證實Caveolin-1在能表達于中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和樹突細胞中，表明其在炎癥細胞的生理學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)白細胞表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在細胞內(nèi)的交通〔6〕。近年來Caveolin-1在血管平滑肌增殖和遷移的作用，越來越引起人們的關(guān)注。Caveolin-1在血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上有著豐富的表達，并與多種生長因子相互作用，調(diào)節(jié)血管平滑肌增殖和遷移。內(nèi)皮素-1通過ETAR促進血管平滑肌增殖的過程中，可以降低Caveolin-1的表達〔7〕;Caveolin-1還可通過調(diào)節(jié)炎癥細胞、內(nèi)皮細胞中信號傳導(dǎo)通路的活性，影響炎癥細胞對炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，進而影響炎癥反應(yīng)過程。TNF-α作為調(diào)節(jié)Caveolin-1表達的主要介質(zhì)，通過其受體(TNFR-1)影響Caveolin-1的表達及生物學(xué)功能，并進一步調(diào)節(jié)多條信號通路的活性。有文獻報道，在肺泡巨噬細胞中，TNF-α可使Caveolin-1表達下調(diào)，使多條炎癥反應(yīng)信號通路激活，引起肺組織損傷。有研究表明，多種血管活性因子促進血管平滑肌增殖時，Caveolin-1表達下降，相反當(dāng)Caveolin-1表達上調(diào)可抑制血管平滑肌細胞的增殖〔3〕。Caveolin-1基因敲除的小鼠的血管平滑肌細胞增殖明顯增強〔8〕。因此可以看出Caveolin-1在血管平滑肌增生和遷移起著重要作用。目前Caveolin-1對血管平滑肌增殖的研究主要其中在細胞水平，而在血管吻合口上還少有研究。

本實驗結(jié)果說明Caveolin-1能明顯抑制吻合口組織中TNF-α、IL-6的表達，并上調(diào)吻合口組織中 IL-10的表達，減少吻合口血管平滑肌細胞的增殖。但目前Caveolin-1對TNF-α、IL-6的具體作用機制還不清楚。

盡管IL-10作為炎癥抑制因子在血管損傷后升高，以抑制炎癥的進一步發(fā)展來對血管損傷后的血管內(nèi)膜增生起保護作用，但并不足以完全阻止狹窄的發(fā)生及發(fā)展，主要起到延緩效應(yīng)〔9〕。隨著分子生物學(xué)及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的不斷發(fā)展，血管局部基因轉(zhuǎn)染已成為治療再狹窄的重要方向，其具有相對簡單、特異性強，在局部發(fā)揮作用而全身反應(yīng)小的優(yōu)勢，目前已廣泛用于多種實驗研究中〔10〕。

綜上所述，Caveolin-1在抗狹窄作用中除了能直接抑制血管平滑肌細胞的增殖與遷移外，還有其抗炎和調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子平衡的作用參與其中。但是本研究并未說明Caveolin-1調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的途徑，對此還有待進一步研究。

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