戴先鵬 畢國(guó)善 鄧禮明 申 昕 熊?chē)?guó)祚 (南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

血管吻合口狹窄是導(dǎo)致血管手術(shù)后遠(yuǎn)期通暢率難以提高的重要原因，其主要病理基礎(chǔ)是血管平滑肌的增殖和遷移，且發(fā)生的過(guò)程與創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程類(lèi)似。血管損傷后的狹窄過(guò)程實(shí)際上是血管對(duì)損傷作出炎癥反應(yīng)并積極參與修復(fù)的過(guò)程〔1〕，在血管損傷后的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，腫瘤壞死因子(TNF-)α和白介素(IL)-6充當(dāng)重要的促炎因子，可刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移，也可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生，從而引起血管內(nèi)膜的增生。小凹蛋白-1(Caveolin-1)是細(xì)胞膜上小凹的結(jié)構(gòu)蛋白，能通過(guò)“腳手架”區(qū)域的共有序列與多種信號(hào)分子相互作用，對(duì)多種信號(hào)分子和血管活性因子起著重要調(diào)節(jié)作用。Caveolin-1能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)過(guò)程。Caveolin-1在血管平滑肌細(xì)胞上有著豐富的表達(dá)〔2〕。多種血管活性因子促進(jìn)血管平滑肌增殖時(shí)，Caveolin-1表達(dá)下降;相反，Caveolin-1表達(dá)上調(diào)可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖〔3〕。本研究探討Caveolin-1對(duì)血管吻合后狹窄的作用以及與炎癥因子的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 健康成年家兔40只，雄性，體重1.5～2.0 kg，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen 公司，兔抗 IL-6(bs-6312R)、兔抗 TNF-α(bs-2150R)、兔抗IL-10(bs-0698R)購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司，鏈霉親合素-生物復(fù)合物(SABC)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司，鼠抗β-actin(CW0096)購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司，鼠抗Caveolin-1(#610058)購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 40只家兔根據(jù)隨機(jī)化原則分為四組。正常組(假手術(shù)組)家兔不作任何處理，手術(shù)組家兔分離剪斷右側(cè)頸總動(dòng)脈后，用6-0 Prolene線間斷外翻縫合;空轉(zhuǎn)染組在血管吻合剩最后1針時(shí)注入空質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合液后縫合，局部孵育30 min;轉(zhuǎn)染組在血管吻合剩最后一針時(shí)注入配好的含pCDNA3.1-Caveolin-1和脂質(zhì)體的混合液，局部孵育30 min。于術(shù)后7、14 d將右側(cè)頸總動(dòng)脈分離，仔細(xì)檢查血管吻合口情況，并觀察血管通暢無(wú)血栓形成后取標(biāo)本。其中術(shù)后7 d的標(biāo)本放入液氮中用于實(shí)時(shí)熒光定量(Real time)PCR及Western印跡檢測(cè)。術(shù)后14 d的標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定，用于免疫組化和HE染色。

1.2.2 Caveolin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配制方法 用已提取好的質(zhì)粒及LipofectamineTM2000分別稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中(兩者的比例為1∶3)，室溫靜置4 min再將兩者混合室溫放置20 min。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察血管內(nèi)膜變化 取待測(cè)吻合口血管組織，甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，樹(shù)膠封片保存。光鏡下觀察血管吻合口形態(tài)。

1.2.4 Real time PCR檢測(cè)吻合口血管組織中Caveolin-1 mRNA的表達(dá) 血管組織標(biāo)本總RNA用Trizol Reagent常規(guī)提取，按試劑盒說(shuō)明，MMLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用β-actin為內(nèi)參照。引物用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。Caveolin-1引物序列:上游5'-AGCATGTCTGGGGGCAAATA-3'，下游 5'-TCACAGTGAAGGTGGTGAAG C-3'，產(chǎn)物為 280 bp。PCR 總反應(yīng)體系 20 μl，含 2 × SYBR Premix Ex TaqTM 10 μl，上、下游引物 10 μmol/L 各 0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 7.2 μl。循環(huán)設(shè)置:95℃10 s，61℃ 20 s，72℃ 15 s循環(huán)38次;于95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s得融解曲線。反應(yīng)完成后，得到所有標(biāo)本的所有記錄點(diǎn)曲線。使用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)分析，調(diào)整基線后，計(jì)算達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)(Ct值)。

1.2.5 Western印跡檢測(cè)血管組織中Caveolin-1蛋白的表達(dá)取血管組織，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，取40 μg蛋白加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PDVF)膜。在5%脫脂牛奶中4℃封閉1 h。按1∶500加入一抗，于4℃孵育過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，5 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠(按照1∶5 000比例稀釋)37℃恒溫箱中孵育45 min，TBST洗4次×15 min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒顯色并攝像分析。

1.2.6 檢測(cè)血管組織中TNF-α、IL-6、IL-10蛋白的表達(dá) 采用SABC法，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)都用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔血管組織病理變化 HE染色可見(jiàn)，正常組血管內(nèi)膜光滑，管壁無(wú)增厚，內(nèi)彈力板完整;手術(shù)組和空轉(zhuǎn)染組血管組織內(nèi)膜、中膜增厚明顯，可見(jiàn)血管管腔狹窄，內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞明顯增生并排列不規(guī)則，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層變性水腫，彈力纖維層顯示不清;轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)膜、中膜亦可見(jiàn)不同程度的增厚，管腔有所狹窄，可見(jiàn)中膜層平滑肌細(xì)胞有較多增生，但增生程度及狹窄程度均較手術(shù)組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

與轉(zhuǎn)染組(0.143±0.008)和正常組(0.078±0.014)比較，手術(shù)組(0.365±0.058)和空轉(zhuǎn)染組(0.421±0.052)的內(nèi)膜中膜面積均顯著增高(P＜0.01);轉(zhuǎn)染組雖高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 家兔血管組織中Caveolin-1 mRNA表達(dá) 與正常組(0.825±0.042)比較，手術(shù)組(0.107±0.019)和空轉(zhuǎn)染組(0.122±0.025)的Caveolin-1 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組(0.735±0.046)Caveolin-1 mRNA明顯升高(P ＜0.05)。

2.3 家兔血管組織中Caveolin-1蛋白表達(dá) Caveolin-1在各組均有表達(dá)，與正常組(0.798±0.012)比較，手術(shù)組(0.397±0.038)和空轉(zhuǎn)染組(0.345±0.027)中Caveolin-1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染組(0.547±0.017)Caveolin-1蛋白表達(dá)明顯高于手術(shù)組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管中TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)TNF-α在內(nèi)皮和平滑肌中均有表達(dá)，手術(shù)組及空轉(zhuǎn)組表達(dá)高于正常組;而與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組表達(dá)下降。與正常組比較，手術(shù)組和空轉(zhuǎn)染組IL-6、IL-10表達(dá)明顯增高;而與手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)染組IL-6表達(dá)明顯降低，IL-10表達(dá)升高。見(jiàn)圖3～圖5。

圖2 各組家兔血管組織中Caveolin-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

Caveolin-1是修飾于Caveolae內(nèi)表面的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，該基因定位于人染色體7q31.1，包含有3個(gè)外顯子，在不同種屬間的結(jié)構(gòu)和序列都保持著高度的相似性〔4〕，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等終末分化細(xì)胞〔5〕。Caveolin-1可以參與細(xì)胞內(nèi)的多種生命活動(dòng)，如膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜的組裝、血管生成和腫瘤形成等。近來(lái)的研究證實(shí)Caveolin-1在能表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中，表明其在炎癥細(xì)胞的生理學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在細(xì)胞內(nèi)的交通〔6〕。近年來(lái)Caveolin-1在血管平滑肌增殖和遷移的作用，越來(lái)越引起人們的關(guān)注。Caveolin-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上有著豐富的表達(dá)，并與多種生長(zhǎng)因子相互作用，調(diào)節(jié)血管平滑肌增殖和遷移。內(nèi)皮素-1通過(guò)ETAR促進(jìn)血管平滑肌增殖的過(guò)程中，可以降低Caveolin-1的表達(dá)〔7〕;Caveolin-1還可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，影響炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)過(guò)程。TNF-α作為調(diào)節(jié)Caveolin-1表達(dá)的主要介質(zhì)，通過(guò)其受體(TNFR-1)影響Caveolin-1的表達(dá)及生物學(xué)功能，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，在肺泡巨噬細(xì)胞中，TNF-α可使Caveolin-1表達(dá)下調(diào)，使多條炎癥反應(yīng)信號(hào)通路激活，引起肺組織損傷。有研究表明，多種血管活性因子促進(jìn)血管平滑肌增殖時(shí)，Caveolin-1表達(dá)下降，相反當(dāng)Caveolin-1表達(dá)上調(diào)可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖〔3〕。Caveolin-1基因敲除的小鼠的血管平滑肌細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)〔8〕。因此可以看出Caveolin-1在血管平滑肌增生和遷移起著重要作用。目前Caveolin-1對(duì)血管平滑肌增殖的研究主要其中在細(xì)胞水平，而在血管吻合口上還少有研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Caveolin-1能明顯抑制吻合口組織中TNF-α、IL-6的表達(dá)，并上調(diào)吻合口組織中 IL-10的表達(dá)，減少吻合口血管平滑肌細(xì)胞的增殖。但目前Caveolin-1對(duì)TNF-α、IL-6的具體作用機(jī)制還不清楚。

盡管IL-10作為炎癥抑制因子在血管損傷后升高，以抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展來(lái)對(duì)血管損傷后的血管內(nèi)膜增生起保護(hù)作用，但并不足以完全阻止狹窄的發(fā)生及發(fā)展，主要起到延緩效應(yīng)〔9〕。隨著分子生物學(xué)及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的不斷發(fā)展，血管局部基因轉(zhuǎn)染已成為治療再狹窄的重要方向，其具有相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，在局部發(fā)揮作用而全身反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛用于多種實(shí)驗(yàn)研究中〔10〕。

綜上所述，Caveolin-1在抗狹窄作用中除了能直接抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移外，還有其抗炎和調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子平衡的作用參與其中。但是本研究并未說(shuō)明Caveolin-1調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的途徑，對(duì)此還有待進(jìn)一步研究。

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